GCMS法测定动物组织中盐酸克伦特罗前处理方法的研究

俞慧红

摘要[目的]建立一种简单、准确、快速而又重现性好的气相色谱-质谱联用法（GCMS）测定动物组织中盐酸克伦特罗的预处理方法。[方法]以猪肝为原料，预处理方法是样品在碱化的条件下用乙酸乙酯提取，用酸性水溶液反萃取，SCX固相萃取小柱净化，经双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BTSFA）衍生后，再采用气质联用仪进行检测其盐酸克伦特罗的含量。[结果]研究显示，该方法下盐酸克伦特罗的回收率为85%～95%，检出限可达0.5 μg/kg。[结论]采用气相色谱-质谱联用法测定动物组织中盐酸克伦特罗的精密度高，重现性好，方法可靠。

关键词盐酸克伦特罗；动物组织；预处理；气相色谱-质谱联用法

中图分类号S851.34+7文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-130-03

Pretreatment of Clenbuterol Hydrochloride in Animal Tissue Detection by GCMS Method

YU HuiHong （Food and Drug Inspection and Testing Center of Cixi City，Cixi，Zhejiang 315300）

Abstract [Objective] To establish a simple，accurate，rapid and repeatable GCMS method，which was a pretreatment method to detect the clenbuterol hydrochloride in animal tissues.[Method] With pig liver as the raw material，extraction was carried out in alkaline condition by ethyl acetate.Acidic aqueous solution was used for backextraction.After purification by SCX solid phase extraction column，and derivation by doubletrimethylsilyl trifluoroacetamide （BTSFA），GCMS was used for detection.[Result] The recovery rate of clenbuterol hydrochloride was 85%95%； and detection limit reached 0.5 μg/kg.[Conclusion] Detecting clenbuterol hydrochloride in animal tissues by GCMS has high precision，good repeatability and reliable results.

Key wordsClenbuterol hydrochloride； Animal tissue； Pretreatment； GCMS

鹽酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB），其化学名为羟甲叔丁肾上腺素或2[（叔丁氨基）甲基]4氨基3，5二氯苯甲醇盐酸盐，药品名为双氯醇胺、克喘素、氨哮素。它是强效选择性β2受体激动剂，有强而持久的松弛支气管平滑肌的作用，将其添加于饲料中，能促进家畜生长，减少酮体脂肪沉积，提高瘦肉率，故又称“瘦肉精”。但食用含盐酸克伦特罗较高的动物组织后，人体会出现肌肉颤动、肌痛、心动过速，甚至恶心、头晕目眩等中毒症状[1]。

目前，盐酸克伦特罗的检测方法已经比较成熟，我国现有的检测标准主要有国家标准GB/T 5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》[2]、农业部推荐性标准NY/T 468-2006《动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱/质谱法》[3]，检测方法主要集中在酶免疫分析法、高效液相色谱法、气质联用仪法等。无论采用哪种方法，前处理的技术要求很高，检测过程繁琐，难于操作，容易出差错，要求检测人员专业性强且具有丰富的实际操作经验[4]。样品的前处理技术得当与否，将直接影响测定试验结果。我国一般将酶免疫分析法作为筛选法，液相色谱法作为半确证法，气质联用法作为确证和仲裁方法，因此，笔者针对气质联用法中样品前处理过程的注意事项展开了讨论，以期得到更加准确、有效的检测数据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料样品。猪肝，购于慈溪浒山菜市。

1.1.2主要试剂。盐酸克伦特罗标准品（纯度99.2%），德国DR公司；双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BTSFA）衍生剂，阿拉丁公司；SCX小柱（500 mg，3 mL），美国安捷伦公司；甲醇、甲苯、乙酸乙酯为色谱纯试剂，美国天地公司；盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、氨水、甲醇均为分析纯，国药集团；高纯氦气（99.99%），上海浦江特种气体有限公司；水为超纯水，由优普超纯水制造系统制备。

1.1.3主要仪器设备。7890A5975C气质联用仪、固相萃取仪，美国安捷伦公司；电子天平（0.01 mg），瑞士梅特勒公司；电子天平（0.01 g），美国赛多利斯公司；T18匀质器、MS3漩涡混合器，德国IKA公司；真空泵，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HSC24A氮吹仪，南京科捷分析仪器有限公司；DGG9240B烘箱，上海森信实验仪器有限公司；TGL20W离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2方法

1.2.1标准溶液配制。标准品储备溶液：称取盐酸克伦特罗标准品50.40 mg（有效浓度99.2%，折算后有效成分为50.00 mg），用甲醇定容至50 mL容量瓶，配成1.0 mg/mL盐酸克伦特罗标准储备溶液。

标准品中间溶液：吸取1 mL上述标准品储备溶液用甲醇定容至100 mL，稀释得到浓度为10 μg/mL盐酸克伦特罗标准溶液，同样方法，稀释得到200 μg/L盐酸克伦特罗标准溶液。

标准溶液系列：各吸取100 μg/L盐酸克伦特罗标准溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶，分别配成4、10、20、40、100 μg/L盐酸克伦特罗标准溶液。

1.2.2仪器条件。气相条件：色谱柱HP5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度280 ℃；柱流量1.0 mL；柱温程序为120 ℃保持3 min，10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min，25 ℃/ min升至270 ℃，保持5 min；不分流进样；进样体积1 μL。

质谱条件：传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；EI电压70 eV；容积延迟5 min；选择特征离子m/z86、m/z212、m/z262、m/z277；定量离子m/z86。

1.2.3样品处理及分析。

1.2.3.1样品提取步骤。称取经处理后的猪肝脏组织样品5.00 g于第1支带盖50 mL塑料离心管，加15 mL乙酸乙酯，再加入3 mL 10.0%碳酸钠溶液，10 000 r/min以上高速匀浆1 min，盖上盖子放入离心机以5 000 r/min的速度离心5 min；匀浆机转子上会粘有很多样品残渣，再用第2支装有10 mL乙酸乙酯的塑料离心管继续以10 000 r/min高速匀浆1 min；取出离心好后的第1支塑料离心管，吸取上层有机溶剂于第3支塑料离心管；将第2支塑料离心管中10 mL乙酸乙酯加入第1支塑料离心管样品残渣中，漩涡混合器上混合1 min，5 000 r/min离心2 min，将上层有机溶液合并到第3支塑料离心管中；在收集的有机溶液中加入5 mL 0.10 moL/L的盐酸溶液，漩涡混合仪混合30 s，再以5 000 r/min的速度离心2 min，吸取上层有机溶液至第4支塑料离心管；在第4支塑料离心管加入5 mL 0.10 moL/L的盐酸溶液，漩涡混合仪混合30 s，再以5 000 r/min的速度离心2 min，吸取上层有机溶液将其弃去；合并第3支和第4支离心管下层水相。

1.2.3.2样品净化处理。SCX小柱依次用5 mL甲醇、5 mL纯水、5 mL 30 mmoL/L盐酸活化，控制流速1 mL/min，弃去流出液；将上述提取液上样至固相萃取小柱，弃去流出液；上样完毕，再依次用5 mL纯水和5 mL甲醇淋洗柱子，弃去淋洗液，并将小柱抽干；再用5 mL 4%氨化甲醇进行洗脱，用带盖的玻璃离心管收集洗脱液。上样时要特别注意控制过柱流速，最好在自身重力作用下自流，如果过柱过程中遇到堵塞，可以適当加压，控制流速最好不要超过1 mL/min。根据NY/T 468-2006标准方法，样品提取液需回调pH至5.2，但对于SCX小柱来说，可以不用回调pH。因为NY/T 468-2006标准中采用的硅胶基质的强阳离子交换小柱，硅胶在pH 2.0～7.5稳定，而SCX小柱填充的聚合物基质则在pH 1.0～14.0中均稳定存在。经过测试，SCX商品小柱不经过调整pH至5.2结果回收率也很好，都保持在85%～100%，而且还避免了调pH反复用酸度计测定时引起样液损耗而带来的影响。

1.2.3.3样品衍生化。上述洗脱液在50 ℃水浴中氮吹至干，加入100 μL甲苯和100 μL硅烷化试剂双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA），试管加盖后于漩涡混合仪混合30 s，放于预热好的80 ℃烘箱衍生1 h，烘箱应该预先加热至所定温度80 ℃。同时吸取盐酸克伦特罗标准溶液系列（4、10、20、40、100 μg/L）各0.5 mL到装有4.5 mL 4%氨化甲醇溶液带盖的玻璃离心管中，50 ℃水浴中氮吹至干，同样操作放烘箱衍生，处理好的样液和标准系列溶液去衍生时，要注意同步进行，尽量避免衍生条件不一致。衍生完毕后，取出冷却至室温，加入0.3 mL甲苯，在漩涡混合仪振荡30 s，转移至进样小瓶中，进行气相色谱-质谱分析。衍生后样液如果有残渣，建议用0.22 μm有机滤膜进行过滤至小样品瓶再上机分析。

2结果与分析

2.1方法线性关系、检出限的测定标准品盐酸克伦特罗经气相色谱-质谱联用法（GCMS）的分析结果见图1和图2。

2可知，在该试验方法的条件下，所有试剂对检测均无干扰，盐酸克伦特罗标准品在GC色谱图中出峰保留时间为12.978 min，其特征离子为m/z86、m/z212、m/z262、m/z277，定量离子为m/z86。

以标准系列溶液进样，测定不同浓度标准系列溶液中盐酸克伦特罗的峰面积。以各标准溶液浓度和对应的峰面积进行线性回归，则有：Y=18.23X+7.283，r2=0.995 396，相关系数大于0.995，说明该方法适用于盐酸克伦特罗的定量分析。将标准溶液稀释至一定浓度的标准溶液，按照3倍信噪比得仪器检出限为5.0 μg/L，方法检出限为0.5 μg/kg。

2.2精密度和回收率经检测，猪肝样品中盐酸克伦特罗为阴性（未检出），称取18份猪肝样品作为空白样品，选择3组标准溶液（10、20、100 μg/L），分别向猪肝空白中加入0.50 mL，3个加标水平各做了6个平行回收试验，计算精密度和回收率。

由表1可知，猪肝样品中盐酸克伦特罗各个浓度点的回收率在85%～95%，而相对标准偏差（RSD）在1.6%～2.2%，符合现行兽药残留的分析要求。

2.3样品测试结果对慈溪市超市和农贸市场所售猪肉和猪肝进行抽样检查，共计32份，结果盐酸克伦特罗均未检出。

3结论与讨论

3.1结论采用气相色谱-质谱联用法对动物组织中的盐酸克伦特罗进行前处理，测得回收试验的回收率在88%～94%，而相对标准偏差（RSD）在1.6%～2.2%，方法检出限为0.5 μg/kg，说明该方法适用于盐酸克伦特罗的定量分析。对32种猪肉和猪肝进行抽样检查，结果盐酸克伦特罗均未检出。

3.2讨论由于盐酸克伦特罗已经全面禁止在动物生产中应用，所以许多国家并没有具体确定动物性产品中最大残留限量值（MRL）。荷兰规定，牛、马肝脏盐酸克伦特罗的MRL值为0.5 μg/kg；英国规定，可食性组织中MRL值为0.5 μg/kg；我国暂未规定。美国食品药品管理局（FDA）和世界卫生组织（WHO）建议，动物组织中的盐酸克伦特罗的MRL值为：肉0.2 μg/kg、肝0.6 μg/kg、肾0.6 μg/kg、脂肪0.2 μg/kg和奶0.05 μg/kg[5]。目前我国使用的液相色谱法、气质联用仪法的最低检测限一般都在0.5 μg/kg以上；酶联免疫法最低检测限可达0.05 μg/kg，但假阳性很高，例如有资料报道，用酶联法检测牛组织中得盐酸克伦特罗可产生6.8%的假阳性，另外有36.0%阳性样品不能被确认[5]。检测方法各有优缺点，无法同时满足定性和定量2个方面的要求。所以，研究快捷、高效、操作简单、价格低廉，且检测限更低的方法迫在眉睫，真正从定性和定量2个方面实现盐酸克伦特罗残留的有效检测。

参考文献

[1] JANES L M，BOOTH N H.兽医药理学与治疗学[M].冯淇辉，申葆和，戎耀方，译.上海：上海科学技术文献出版社，1985：52-85.

[2] 吴永宁，苗虹，赵云峰，等.动物性食品中克伦特罗残留量的测定：GB/T 5009.192-2003[S].北京：中国标准出版社，2003.

[3] 吴银良，刘素英，单吉浩，等.动物组织中盐酸克伦特罗的测定 气相色谱/质谱法：NY/T468-2006[S].北京：中国农业出版社，2006.

[4] 黄小洁，朱永仁.盐酸克伦特罗检测方法的比较和应用[J].现代农业科技，2011（15）：37-39.

[5] 刘国艳，柴春彦.动物性产品中盐酸克伦特罗检测方法进展[J].动物科学与动物医学，2002，19（4）：32-34.