整体柱承载形态对柯衣定SERS检测效果的影响

徐燕英 余慧 谢云飞等

摘要[目的]针对食品中屡禁不止的违禁添加色素柯衣定，拟建立一种以整体柱为活性增强基底、适合大批量样品快速筛查的表面增强拉曼散射（SERS）技术。[方法]在确定整体柱的合成后，以整体柱的柱状及其粉碎后的粉末为基底，优化金溶胶与样品的混合比例、体系pH、取样量和检测时间，分别建立柯衣定SERS检测方法。[结果]以整体柱的柱状及其粉碎后的粉末为基底分别建立柯衣定的SERS检测方法，其检测限分别为0.10和0.25 μg/mL；在10.0 μg/mL浓度下，柯衣定在整体柱柱状和粉状承载形态下获得的整体增强效果相近，1 138和1 171 cm-1处峰位移在柱状SERS检测中的信号强度明显优于粉状SERS检测结果，且柱状的SERS信号更稳定。[结论]建议采用整体柱的柱状形态进行SERS检测，更具实用价值，有望应用于大批量样品进行快速筛查。

关键词整体柱；表面增强拉曼（SERS）；柯衣定

中图分类号TS207文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-020-04

Effects of Bearing Forms of Monolithic Column on the SERS Detection of Chrysoidine

XU Yanying1，2， YU Hui2， XIE Yunfei2，3 YAO Weirong2* et al （1. Market Supervision Administration of Gusu District， Suzhou， Jiangsu 215100； 2. School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi， Jiangsu 214122；3. Jiangsu Kangzhi Yuan Grain and oil Group Co.，LTD，Suqian，Jiangsu 223600）

Abstract[Objective] To establish a Surfaceenhanced Raman Spectroscopy （SERS） technology for rapid screening of mass samples， with monolithic column as the active substrate. [Method] After ensuring that the monolithic column was synthesized， the detection conditons were optimized based on different bearing forms of monolithic column， including the ratio of gold colloids to sample， pH of system， and Raman detection time. SERS detection method of chrysoidine was established. [Result] With the cylindricity and powder of monolithic column as the substrates， SERS detection limits were 0.10 and 0.25 μg/mL respectively. Under the 10.0 μg/mL concentration， their enhancing effects were close. Signal strengths of 1 138 and 1 171 cm-1 peak shifts in cylindricity SERS detection were significantly superior to those in powder SERS detection.And the cylindricity SERS signal was more stable. [Conclusion] Cylindricity of monolithic column should be used for SERS detection， which has greater practical value， and can be applied in the rapid screening of mass samples.

Key wordsMonolithic column； Surfaceenhanced Raman Spectroscopy； Chrysoidine

由于天然色素在食品加工過程中容易变色，工业染料柯衣定（别名：碱性橙II）价格低廉，颜色鲜艳，易溶于水，比其他人工合成色素，如日落黄、柠檬黄等更容易对食品上色且不易褪色，因此容易被一些不法商贩滥用于黄鱼、豆制品、腐竹、辣椒粉等食品中。目前柯衣定的检测方法主要有高效液相色谱法[1]、超高效液相色谱-串联质谱法[2]、液相色谱-串联质谱法[3]、反相高效液相色谱法[4]、薄层色谱扫描法[5]、比色法[6]等，均不适合对大批量样品进行快速筛查。

拉曼光谱（Raman spectroscopy）能够提供分子振动能和转动能方面的信息，每种物质在单色强光照射下均能产生特定的分子振动能和转动能变化，产生独一无二的拉曼光谱，因而能对物质进行指纹定性乃至定量鉴定。粗糙纳米表面结构能将拉曼信号增强106倍[7]，称为表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，简称SERS）。通过SERS技术能得到高于普通拉曼14个数量级的检测效果[8]，极大地提高了拉曼光谱灵敏度，能够用于检测更低浓度的待测物质，最终达到单分子检测的目的[9]。目前常用的主流SERS基底有贵金属溶胶[10]、金银纳米棒[11]、金属电极[7]、金属岛膜[12]、核壳材料[13]、多孔氧化铝模板[14]等。基底的表面粗糙度影响SERS信号的增强，目前应用最广泛的经典SERS基底是金、银溶胶[15]。Svec等[16]采用空管柱“原位”聚合法制得性能优良的刚性整体柱，常作为色谱柱内连续床固定相应用于液相色谱中[17-18]，其物理和化学稳定性好，表面非特异性吸附小，重复性好，易于制备，适用的pH范围宽，具有丰富的纳米级别的孔径分布和粗糙表面结构等优点，是一种具有极大发展潜力的SERS增强活性基底。研究表明，结合了纳米银溶胶整体柱用于检测R6G，检测限可低达10-18 mol/L[19]。整体柱的孔径分布结构能够通过改变单体交联剂含量、致孔剂组成比例及反应温度来进行调整[20]。针对近年来频繁曝光的柯衣定违禁添加问题，笔者通过改变单体交联剂含量、致孔剂组成及温度来调节整体柱的孔径，得到吸附聚集纳米金粒子的SERS增强材料，通过整体柱的扫描电镜图，以及结合对10 μg/mL柯衣定的SERS增强效果评价整体柱的SERS增强性能；并分别以其柱状及其粉末状态使用，分别建立柯衣定的检测方法，考察其检测限，从而评估其实用价值。

1材料与方法

1.1试验材料与仪器柯衣定（≥97%）：上海染料研究所；氯金酸钾（≥99%）：Sigma，USA；甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、环己醇、十二醇、过氧化苯甲酰（AR）：百灵威科技有限公司。RamTracer200HS便携式激光拉曼检测分析仪：美国，785 nm激发光波长，100～3 300 cm-1光谱扫描范围，334 mW最大激光功率，6 cm-1分辨率，含简易型液体样品池和固体样品检测台；Hitachi S4800 型场发射扫描电子显微镜（Hitachi）：日本。

1.2密度泛函数理论计算（DFT）采用GaussView 5.0软件初步绘制柯衣定的3D分子模型，得到原始计算化学文件；用Ultra Edit32软件对原始文件进行名称编辑、路径修改、优化命令和参数设定、分子带电荷及自旋多重度设定；修改之后文件用FSecure SHH软件上传至安装Linux系统的计算专用电脑中，使用Gaussian 09软件对柯衣定的3D分子模型进行结构优化，依次采用HF、B3LYP算法结合321G、631G、631G（d）、6311G（d）命令基组，逐渐调整柯衣定分子的3D模型结构；最后采用freq=raman命令计算柯衣定分子的理论拉曼光谱，得到最终计算化学文件；采用Gauss View 5.0软件打开最终文件，得到柯衣定分子的理论拉曼光谱峰以及每个峰对应的分子振动形式。

1.3整体柱材料的制备及表征参照整体柱经典合成方法[16]，用一次性玻璃注射器分别量取一定比例的单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、交联剂乙二醇二甲基丙烯酸（EDMA）、致孔剂（环己醇和十二醇），按照GMA∶ EDMA∶环己醇∶十二醇=24∶16∶54∶6（V∶V∶V∶V）比例混合于烧杯中，加入引发剂（BPO），用保鲜膜将烧杯密封并氮吹15 min，在氮气保护下将反应溶液分装入10 mL离心管中，盖上离心管盖并竖直放置于55 ℃恒温水浴锅中反应24 h；反应完毕后，用打火机将离心管底部烧熔，方便取出整体柱；将取出的整体柱用无水乙醇浸泡2 h除去残余反应液，再用30 ℃烘箱烘干；将上述整体柱切成1 cm 长的圆柱，并在横截面上抠出一个小凹槽做样品池。残余的整体柱碎末研磨成粉备用。

用小刀将整体柱刮出横截面表层薄片，采用日本的Hitachi S4800场发射扫描电子显微镜对整体柱进行结构表征，同时结合色素在整体柱上的SERS检测效果对整体柱的合成条件进行优化。

1.4金溶胶的制备及表征金溶胶采用Fleischmann等[21]的经典化学还原法制备。

1.5拉曼检测采用便携式拉曼检测仪RamTracer200HS（OptoTrace Technologies Co.Ltd），785 nm激发光，激发光功率334 mW，拉曼信号积分时间10 s，积分2次，每个样品平行检测2次。

1.6SERS检测柯衣定色素方法的优化

1.6.1整体柱柱状与粉状承载形态的选取。称取不同量的整体柱粉末小心放到载玻片上聚拢，盖上一层载玻片，以整体柱粉末的位置为中心用力按压2次，每次保持5 s，形成直径1 cm的整体柱粉末平面，吸取50 μL等体积比的金溶胶柯衣定混合液轻轻滴加在整体柱粉未表面进行拉曼检测。

1.6.2最佳检测时间的选取。吸取50 μL等体积比的金溶胶柯衣定混合液到0.010 g整体柱粉末上和整体柱表面凹槽内进行拉曼检测。

1.6.3金溶胶与样品比例的选取。将柯衣定与金溶胶不同体积比混匀后，吸取50 μL混合溶液到0.010 g整体柱粉末上和整体柱表面凹槽内进行拉曼检测。

1.6.4样品pH的选取。吸取6份金溶膠与柯衣定1.0∶1.5体积比的混合液，加入不同量的0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH溶液，分别调节pH为1.01、3.10、4.27、6.58、7.74、9.15，吸取50 μL混合溶液到0.010 g整体柱粉末上和整体柱表面凹槽内进行拉曼检测。

1.7数据处理采用Raman Analyzer软件导出Excel数据表，再用Origin 8.1软件绘制图表。

2结果与分析

2.1整体柱的优化制备与表征选用金溶胶作为整体柱的辅助SERS活性基底，通过优化制备得到的整体柱基底扫描电镜结果见图1A。由图1A可知，50 nm左右的纳米金颗粒在整体柱纳米级孔径结构上吸附聚集。用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液调整检测体系的pH，得到柯衣定在整体柱上的SERS信号（图1B）。由图1B可知，pH为9.15的柯衣定SERS检测峰与固体拉曼峰和pH 4.27的SERS检测峰有较大差别，尤其是1 250～1 550 cm-1峰位移区域，pH 9.15的检测环境下，该区域1 382 cm-1位移处的峰被显著增强，将旁边强度较弱的峰掩盖。结合理论计算结果，该区域注：A.整体柱基底的SEM照片，B.柯衣定的拉曼图谱；a.柯衣定的理论计算拉曼光谱，b.试验测得柯衣定的固体拉曼光谱，c.pH 4.27时柯衣定在整体柱上的SERS光谱，d.pH 9.15时柯衣定在整体柱上的SERS光谱。荷分布改变，分子运动强度发生改变，从而峰形有所改变。因此，当pH为9.15时，柯衣定的定性特征峰为518、994、1 138、1 171、1 298、1 382、1 451、1 584、1 610 cm-1。

2.2整体柱不同承载形态下检测柯衣定的条件优化

2.2.1最佳检测时间。在整体柱材料上进行连续SERS检测，观测其信号强度，结果见图2。由图2可知，随着时间的推移，柯衣定在整体柱材料上的SERS信号逐渐增强到最佳状态后，又逐渐减弱，甚至消失，SERS信号只能在一个短时间范围内保持良好的状态。针对柱状，最佳检测时间段为20～30 s；针对粉末状，最佳检测时间段为15～25 s。

结合SERS增强信号的化学增强原理以及整体柱材料的信号增强原理，推测随着时间的推移，被测溶液中的溶剂从整体柱材料内部孔隙结构分流，被测分子的浓度逐步增大，所以检测到逐渐增强的SERS信号；当溶剂完全流出，被检测物质处于干燥环境中时，溶液中的纳米金颗粒完全聚沉在整体柱表面，柯衣定分子没有足够的空间与纳米金颗粒充分结合，破坏了有效的分子极化率，因此导致SERS信号逐渐降低。

2.2.2金溶胶与样品比例。由图3可知，柯衣定过量或量不足时，测得的SERS信号都不是最强，与理论分析结果一致。对于柱状，金溶胶与10.0 μg/mL柯衣定体积比为1.0∶1.5的SERS检测效果最优；对于粉末，金溶胶与2.5 μg/mL柯衣定体积比为1.0∶1.5的SERS检测效果最优。

2.2.3样品pH。采用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调整检测体系的pH，于最优整体柱上最佳检测时间范围内对柯衣定进行SERS检测，结果见图4。由图4可知，当pH升高时，柯衣定的峰形更加清晰稳定，SERS检测信号也大大增强。与整体柱柱状承载形态不同的是，整体柱粉末状态检测时，pH 7.74时对柯衣定的SERS检测效果略优于pH 9.15时的检测效果。

安徽农业科学2016年2.3以整体柱为基底SERS法检测柯衣定的检测限将518、994、1 138、1 171、1 298、1 382、1 451、1 584、1 610 cm-1处峰位移为柯衣定的定性特征峰，检测不同浓度下的信号，结果见图5。由图5可知，随着柯衣定浓度的减小，柯衣定的SERS信號强度也逐渐减小，能检测到的特征峰也逐渐减少，对于柱状，柯衣定的最低检出浓度为0.1 μg/mL，而对于粉末，柯衣定的最低检出浓度为0.25 μg/mL，略低于整体柱柱状SERS检测方法。

2.4整体柱不同承载形态检测方法的比较由图6可知，同一浓度下的柯衣定在整体柱柱状和粉状承载形态下获得的整体增强效果相近，1 138和1 171 cm-1处峰位移在柱状SERS检测中的信号强度明显优于粉状SERS检测结果。

由表1可知，2种方法在检测条件和SERS增强原理上非常相似，对柯衣定的SERS检测限分别为0.10和0.25 μg/mL，整体柱柱状对柯衣定的检测略优于粉状。由于整体柱粉末检测法操作较繁琐，粉末的用量对检测效果影响很大，且整体柱粉末质轻易漂浮，导致检测信号不稳定，而整体柱柱状检测法材料准备较简单，检测效果在一段时间范围内能够保持稳定，因此，建议采用整体柱柱状SERS检测法进行试验。

3结论与讨论

该研究建立了一种以整体柱为SERS增强活性基底的检测技术。在对整体柱SERS增强基底进行制备和优化的基础上，确定了能使SERS增强信号最强的整体柱合成方法。使用SEM对整体柱上SERS检测活性位点进行表征，观察到纳米金颗粒在整体柱上呈吸附聚集状态；建立了柯衣定在整体柱柱状和粉末承载状态下的SERS检测法。在柱状承载状态下，金溶胶与样品按照1.0∶1.5体积比混合后，调整体系pH为9.15，在20～30 s检测时间范围内的SERS检测信号最好且最稳定，检测限为0.1 μg/mL；在粉状承载状态下，金溶胶与样品按照1.0∶1.5体积比混合后，调整体系pH为7.74，取50 μL混合液在15～25 s检测时间范围内在0.010 g整体柱粉末上的SERS检测信号最好，检测限为0.25 μg/mL，检测信号的稳定性不如整体柱柱状SERS法。该研究建立的以整体柱为SERS增强活性基底的检测方法，有望用于违禁添加色素柯衣定的快速筛查，但尚需要推广应用于其他种类的违禁色素，并深入探索进行定量检测的可能性。

整体柱材料的孔径分布与SERS信号的增强息息相关。孔径过大，结合了柯衣定的纳米金粒子容易通过整体柱内部孔径；另外，由于整体柱本身并不具备电磁特性，也不带电荷，因此需要选择一种有效的辅助增强基底。目前应用最广泛的SERS增强活性基底是金、银、铜溶胶[22]，由于该研究所用便携式激光拉曼仪的激发波长为785 nm，金溶胶在此波长下的拉曼检测效果优于其他溶胶，因此该试验选用金溶胶作为整体柱的辅助SERS活性基底。

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