ADAM17、EGFR和Ki—67在脑胶质瘤中的表达及意义

呼铁民 孙影 卢庆韬

[摘要] 目的 探討解聚素-金属蛋白酶（ADAM17）、表皮生长因子受体（EGFR）和Ki-67在胶质瘤中的表达及其临床意义。 方法 选取2010年1月～2013年12月承德医学院附属医院收治的69例患者的手术切除标本，其中脑外伤手术减压的脑组织9例为对照组， I～II级恶性胶质瘤23例为低度恶性组， III～IV级恶性胶质瘤37例为高度恶性组；采用免疫组化法检测ADAM17、EGFR和Ki-67在3组标本中的表达情况，并分析ADAM17、EGFR和Ki-67与脑胶质瘤恶性程度的相关性及三者之间表达的相关性。 结果 ADAM17、EGFR和Ki-67在正常对照组中不表达或弱阳性表达，ADAM17、EGFR和Ki-67在低度恶性组中阳性表达率分别为56.5%（13/23）、39.1%（9/23）和26.1%（6/23），ADAM17、EGFR和Ki-67在高度恶性组中阳性表达率分别为94.6% （35/37）、73.0%（27/37）和86.5%（32/37）。随着恶性程度的提高，ADAM17、EGFR和Ki-67的阳性表达率均显著增高（P < 0.01）。相关性分析表明ADAM17和EGFR、Ki-67和ADAM17及Ki-67和EGFR之间比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 ADAM17、EGFR和Ki-67与脑胶质瘤的恶性度密切相关，三者联合检测有助于胶质瘤恶性程度分级的判断。

[关键词] 脑胶质瘤；解聚素-金属蛋白酶17；表皮生长因子受体；Ki-67

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（b）-0021-04

Expression and clinical cignificance of ADAM17， EGFR and Ki-67 in Glioma

HU Tiemin1，2 SUN Ying1▲ LU Qingtao3

1.Department of Pathology， Basic Medical Science College， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063000， China； 2.Department of Neurosurgery， the Affiliated Hospital of Chengde Medical College， Hebei Province， Chengde 067000， China； 3.Department of Surgery， Tangshan Railway Hospital， Hebei Province， Tangshan 063000， China

[Abstract] Objective To explore expression and clinical significance of ADAM17， EGFR and Ki-67 in human glioma. Methods 69 surgical samples were selected in the Affiliated Hospital of Chengde Medical College from January 2010 to December 2013， including 9 cases of brain tissue from brain trauma after surgery decompression （control group）， 23 cases of low grade glioma （low grade group） and 37 cases of high grade glioma （high grade group）. Expression of ADAM17， EGFR and Ki-67 were detected in all samples by immunohistochemical staining. The correlation between expression of ADAM17， EGFR and Ki-67 and the malignant degree of glioma were analyzed. Furthermore， the correlation between ADAM17 and EGFR， ADAM17 and Ki-67， as well as EGFR and Ki-67 in glioma were analyzed. Results There was negative expression or weak expression of ADAM17， EGFR and Ki-67 in the control group. The positive expression rate of ADAM17， EGFR and Ki-67 was 56.5% （13/23）， 39.1% （9/23） and 26.1% （6/23） in low grade group respectively. The positive expression rate of ADAM17， EGFR and Ki-67 was 94.6% （35/37）， 73.0% （27/37） and 86.5% （32/37） in high grade group respectively. The positive expression rate of Ki-67， EGFR and ADAM17 increased significantly with the increase of malignancy degree （P < 0.01）. Correlation analysis showed positive correlation between EGFR and EGFR， Ki-67 and ADAM17， Ki-67 and ADAM17 （P < 0.01）. Conclusion ADAM17， EGFR and Ki-67 are closely related to the malignant degree of glioma. The combined detection of thse markers is helpful to classify the malignant degree of glioma.

[Key words] Gliom； Adisintegrin and metalloprotease 17； Epidermal growth factor receptor； Ki-67

脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，呈浸润性生长，具有恶性度高、易复发、治疗效果差的特点[1]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受体，与配体结合后酪氨酸残基发生磷酸化，激活细胞内信号传导通路，诱导肿瘤细胞增殖和侵袭[2]。解聚素-金属蛋白酶17（adisintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）是近年来新发现的一种基因，属于ADAM家族。ADAM17具有蛋白剪切酶样作用，在多种恶性肿瘤中都呈异常表达，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭等行为[3]。最新研究表明ADAM17可通过剪切EGFR使其活化[4]。本研究前期显示ADAM17在脑胶质瘤组织中表达增高，但ADAM17与EGFR在胶质瘤中的关系及意义目前并不清楚。Ki-67是一种细胞增殖相关核蛋白，可反映肿瘤细胞增殖活性。本研究利用免疫组织化学法检测60例原发性脑胶质瘤组织中ADAM17、EGFR和Ki-67的表达情况，并分析三者之间的相关性，以探讨ADAM17、EGFR和Ki-67在脑胶质瘤中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般材料

收集2010年1月～2013年12月承德醫学院附属医院收治的60例脑胶质瘤手术的切除标本，所有患者术前未经过放化疗。其中男32例，女18例；年龄27～76岁，中位年龄45岁。60例脑胶质瘤中，星形细胞瘤12例，少突胶质细胞瘤11例，间变型星形细胞瘤9例，胶质母细胞瘤28例。按2007年WHO有关神经系统肿瘤分级，将上述患者分为低度恶性组（I～II级胶质瘤23例）和高度恶性组（III～IV级胶质瘤37例）。另外，取脑外伤手术减压的脑组织9例作为对照组。

1.2 主要试剂

兔抗人ADAM17多克隆抗体购自美国Adcam公司；鼠抗人EGFR单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体Ki-67、DAB显色剂、SABC-POD试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫组织化学染色法

石蜡切片经脱蜡、高压抗原修复后，3% H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。血清封闭后，滴加抗ADAM17、EGFR和Ki-67的I抗（1︰100稀释），4℃过夜，次日用PBS冲洗，滴加相应II抗，孵育30 min，PBS冲洗，滴加SABC（链酶亲和素-生物素-过氧化物酶），继续孵育30 min后DAB显色，苏木精复染，脱水透明，显微镜下观察。阴性对照组以PBS代替一抗。

1.4 结果判定方法

400 倍光镜下观察，每例选择3张切片，每张切片随机选5个视野。光镜下ADAM17和EGFR蛋白以细胞浆内出现棕黄色细颗粒为阳性表达，Ki-67阳性表达主要在细胞核出现棕黄色颗粒。参照文献[5]，根据阳性细胞的百分率分为4个等级，0分：无阳性细胞；1分：<30%；2分：30～70%；3分：>70%。按染色强度分为4个等级，0分：无阳性细胞；1分：染色呈浅黄色；2分：呈黄色；3分：棕黄色。阳性细胞数评分与染色强度评分相加作为最后综合评分：阴性（0分）；弱阳性（1～2分）；阳性（3～4分）；强阳性（5～6分）。阳性表达率为所有阳性结果的百分率。

1.5 统计学方法

结果采用SPSS 18.0统计软件对所获数据进行统计学处理，选用χ2检验进行数据分析，ADAM17、EGFR和Ki-67之间的相关性采用Spearman等级相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAM17的表达情况

ADAM17在对照组中阳性表达率为22.2%（2/9），2例阳性表达全部是弱阳性。60例脑胶质瘤组织中，ADAM17的阳性表达率为80.0%（48/60），其中低度恶性组的阳性表达率是56.5%，以阳性表达为主；高度恶性组的阳性表达率是94.6% ，以强阳性表达为主。低度恶性组和高度恶性组的阳性率比较差异有统计学意义（χ2=10.58，P < 0.01）。见图1、表1。

A：对照组；B：低度恶性组；C：高度恶性组

图1 解聚素-金属蛋白酶17在不同恶性程度的脑胶质瘤中的表达（400×）

表1 ADAM17在不同恶性程度的脑胶质瘤中的表达

注：ADAM17：解聚素-金属蛋白酶17

2.2 EGFR的表达情况

EGFR在对照组中无表达。60例脑胶质瘤组织中，EGFR的阳性表达率为60.0%（36/60），其中低度恶性组的阳性表达率是39.1%，以阳性表达为主；高度恶性组的阳性表达率是73.0%，以强阳性表达为主。低度恶性组和高度恶性组的阳性率比较差异有统计学意义（χ2=6.77，P < 0.01）。见图2、表2。

A：对照组；B：低度恶性组；C：高度恶性组

图2 表皮生长因子受体在不同恶性程度的脑胶质瘤中的表达（400×）

表2 EGFR在不同恶性程度的脑胶质瘤中的表达

注：EGFR：表皮生长因子受体

2.3 Ki-67的表达情况

Ki-67在对照组中无表达。60例脑胶质瘤组织中，Ki-67的阳性表达率为63.3%（38/60），其中低度恶性组的阳性表达率是26.1%；高度恶性组的阳性表达率是86.5%，以强阳性表达为主。低度恶性组和高度恶性组的阳性率比较差异有统计学意义（χ2=22.28，P < 0.01）。见图3、表3。

2.4 ADAM17、EGFR和Ki-67表达的相关性

60例脑胶质瘤组织中，ADAM17和EGFR两者双阴性的表达率为15.0%（9/60），双阳性的表达率为56.7%（34/60），统计结果显示两者呈明显的正相关性（r = 0.612，P < 0.01）；ADAM17和Ki-67两者双阴性的表达率为15.0%（8/60），双阳性的表达率为56.7%（35/60），统计结果显示两者呈明显的正相关性（r = 0.574，P < 0.01）；EGFR和Ki-67两者双阴性的表达率为18.3%（11/60），双阳性的表达率为41.7% （25/60），统计结果显示两者呈明显的正相关性（r = 0.447，P < 0.01）。

3 讨论

脑胶质瘤发病机制复杂，临床治疗效果差，深入研究其发病机制有助于找到更好的预防、诊断、治疗胶质瘤的方法。EGFR是原癌基因CerB1 （HER1） 的表达产物，是表皮生长因子受体家族成员之一，该家族包括HER1、HER2、HER3 和HER4[2]。EGFR 信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥着重要的作用[6]。研究表明，在许多实体肿瘤中EGFR基因出现扩增、重排或突变， 使其表达增多或持续活化，借助于下游的信号转导途径，EGFR促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及抑制细胞凋亡等[7]。本研究结果显示EGFR在对照组中无表达，在脑胶质瘤组织中随着恶性程度的增加表达逐渐增强，在60例胶质瘤组织中EGFR总的阳性表达率为60.0%，低度恶性组的阳性表达率（39.1%）和高度恶性的阳性表达率（73.0%）比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。这与文献中的报道基本一致，说明EGFR参与胶质瘤的发生发展。EGFR在分化差的胶质瘤中表达强度明显增高，其高表达可认为是胶质瘤分化不良的标志，与胶质瘤恶性程度密切相关[8]。

ADAM17在人类多种恶性肿瘤中都有异常表达，研究发现ADAM17在乳腺癌、胃癌、肝癌和肺癌等多种癌细胞中表达均增高，其可以通过EGFR-PI3K-AKT信号通路促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移[9-12]。张艳等[13]曾利用免疫印记法检测发现ADAM17在脑胶质瘤中表达增高。本研究采用免疫组织化学法，发现ADAM17在胶质瘤中的阳性表达率（80.0%）显著高于对照组（22.2%），且高度恶性组的阳性表达率（94.6%）明显高于低度恶性组的阳性表达率（56.5%），差异均有统计学意义（P < 0.01），说明ADAM17在脑胶质瘤中表达增多，且随着胶质瘤恶性程度的增高表达更为强烈。Wu B等[14]也报道ADAM17在高度恶性胶质瘤组织中的表达高于低度恶性的胶质瘤。提示ADAM17与脑胶质瘤的发生和发展过程密切相关。ADAM17具有蛋白剪切酶样作用，通过剪切使蛋白细胞膜外功能区脱落，激活或释放许多结构和功能不同的分子，从而调节细胞的多种生物学行为[15-17]。研究显示，ADAM17可剪切活化脱落双调蛋白、TGF-β等EGFR的配体，活化EGFR及其通路，增强肿瘤细胞的增殖和运动活性[18]。本研究中相关性分析结果显示，ADAM17与EGFR呈正相关关系（r=0.612，P < 0.05），说明ADAM17与EGFR密切相关，ADAM17对EGFR可能具有调节作用。

Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，在静止期细胞中不表达，但在各期增殖细胞中均有表达，因此可反映细胞增殖水平，被认为是评估肿瘤增殖活性常用的最可靠的指标[19-20]。本研究结果显示Ki-67在对照组中无表达，而在胶质瘤中阳性表达率高达63.3%，且高度恶性组的阳性表达率（86.5%）显著高于低度恶性组的阳性表达率（26.1%）。说明随着胶质瘤恶性程度的增加，肿瘤细胞的增殖能力亦增加。另外，本研究还进一步发现Ki-67的表达与ADAM17、EGFR的表达呈正相關关系（r = 0.574、0.447，P < 0.05），表明ADAM17和EGFR与胶质瘤细胞异常增殖有关，提示ADAM17和EGFR可能具有促进胶质瘤细胞增殖的作用。

综上所述，ADAM17、EGFR均在脑胶质瘤的发生和发展中发挥了重要作用，Ki-67可作为判断肿瘤恶性程度及预后的一个有价值的辅助指标，ADAM17、EGFR和Ki-67与脑胶质瘤的分化程度和增殖能力密切相关。联合检测ADAM17、EGFR和Ki-67并结合临床参数对指导临床治疗和评价预后有一定应用价值。

[参考文献]

[1] 孙增峰，李文良，谷峰，等.胶质瘤耐药相关机制的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2011，18（7）：551-556.

[2] Stupp R，Hegi ME，Mason WP，et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study：5-year analysis of the EORTC-NCIC trial [J]. Lancet Oncol，2009，10（5）：459-466.

[3] Lu Y，Jiang F，Zheng X，et al. TGF-betal promotes motility and invasiveness of glioma cells through activation of ADAM 17 [J]. Oncol Rep，2011，25（5）：1329-1335.

[4] Oikawa H，Maesawa C，Tatemichi Y，et al. A disintegrin and metalloproteinase 17 （ADAM17） mediates epidermal growth factor receptor transactivation by angiotensin II on hepatic stellate cells [J]. Life Sci， 2014，97（2）：137-144.

[5] Mochizuki S，Okada Y. ADAMs in cancer cell proliferation and progression [J]. Cancer Sci，2007，98（5）：621-628.

[6] Yarden Y，Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network [J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2001， 2（2）：127-137.

[7] Liu L，Ichimura K，Petterson EH，et al. Chromosome 7 rearrange-ments in glioblastomas；loci adjacent to EGFR are independently amplified [J]. J Neuropathol Exp Neurol，1998，57（12）：1138-1145.

[8] 韩影，刁文卓，陈萍.脑胶质瘤中VEGF、EGFR表达意义研究[J].中国实验诊断学，2012，16（2）： 320-321.

[9] Ali N，Knaüper V. Phorbol ester- induced shedding of the prostate cancer marker transmembrane protein with epidermal growth factor and two follistatin motifs 2 is mediated by the disintegrin and metalloproteinase- 17 [J]. J Biol Chem，2007，282（52）：37378-37388.

[10] Zheng X，Jiang F，Katakowski M，et al. ADAM17 promotes breast cancer cell malignant phenotype through EGFR-PI3K-AKT activation [J]. Cancer Biol Ther，2009，8（11）：1045-1054.

[11] Giricz O，Calvo V，Peterson EA，et al. TACE- dependent TGFα shedding drives triple-negative breast cancer cell invasion [J]. Int J Cancer，2013，133（11）：2587-2595.

[12] 刘宏斌，杨其昌，沈屹，等.去整合素-金属蛋白酶17mRNA和蛋白在食管鱗癌组织中的表达及其临床意义[J].中华肿瘤杂志，2013，35（5）：361-365.

[13] 张艳，张雪鹏，吕捷，等.ADAM17 在脑胶质瘤中表达的研究[J].肿瘤学杂志，2013，19（4）：307-308.

[14] Wu B，Sha L，Wang Y，et al. Diagnostic and prognostic value of a disintegrin and metalloproteinase-17 in patients with gliomas [J]. Oncol Lett，2014，8（6）：2616-2620.

[15] Black RA. Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme [J]. Int J Biochem Cell Biol，2002，34（1）： 1-5.

[16] Lu Y，Jiang F，Zheng X，et al. TGF-betal promotes motility and invasiveness of glioma cells through activation of ADAM17 [J]. Oncol Rep，2011，25（5）：1329-1335.

[17] Wang XJ，Feng CW，Li M. ADAM17 mediates hypoxia-induced drug resistance in hepatocellular carcinoma cells through activation of EGFR/PI3K/Akt pathway [J]. Mol Cell Biochem，2013，380（1-2）：57-66.

[18] Borrel-Pages M，Rojo F，Albanell J，et al. TACE is required for the activation of the EGFR by TGF-alpha in tumors [J]. EM BO J，2003，22：114-124.

[19] Brodzki A，Lopuszyński W，Brodzki P，et al. Diagnostic and prognostic value of cellular proliferation assessment with Ki-67 protein in dogs suffering from benign and malignant perianal tumors [J]. Folia Biol （Krakow），2014， 62（3）：235-241.

[20] Wykosky J，Fenton T，Furnari F，et al. Therapeutic targeting of epidermal growth factor receptor in human cancer：successes and limitations [J]. Chin J Cancer，2011， 30（1）：5-12.

（收稿日期：2015-11-15 本文编辑：赵鲁枫）