多抗菌素发酵动力学研究

吴刚 胡永红 杨洋 顾鹏飞 杨文革 王春晓 丁志雯 曹峥

摘要： 通过测定菌丝体干重、多抗菌素含量和底物浓度，研究链霉菌NJYHWG66382发酵动力学方程。结果表明，这3个动力学模型能较好的解释发酵试验结果，选择Logistic模型来描述链霉菌生长曲线，利用Leudeking-Piret方程描述多抗菌素合成的动力学过程，发现该链霉菌生产多抗菌素的发酵类型属于部分生长偶联型；最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的动力学规律。

关键词： 多抗菌素； 发酵； 动力学模型

中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1179-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.023

Study on Fermentation Kinetics of Polyoxins

WU Gang，HU Yong-hong，YANG Yang，GU Peng-fei，YANG Wen-ge，WANG Chun-xiao，DING Zhi-wen，CAO Zheng

（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China）

Abstract： Substrate concentration， dry cell weight and content of polyoxins were measured to establish fermentation kinetics equation of Streptomyces NJYHWG66382. It was proved that the three kinetics equations can explain the result well. Logistic model was used to describe the growth curve of streptomycete， Leudeking-Piret model was used to describe the produce of polyoxins， which showed that the process was partial coupling type growth. Then Leudeking-Piret-Like model was employed to describe the consumption of substrate. The parameters were calculated and the factors are obtained that affecting the yield of polyoxins， which could lay a theoretical foundation for expanded production of polyoxins.

Key words： polyoxins； fermentation； kinetic model

多抗菌素（Polyoxins）又被称为多效霉素、多氧霉素、多抗霉素，为一系列结构相似的肽嘧啶核苷类抗生素[1，2]。最早由日本科研制药株式会社在1965年从可可链霉菌阿苏变种发酵液中提取得到[3]。自1965年发现至今，多抗菌素廣泛应用于防治番茄灰霉病、水稻纹枯病和梨黑斑病等植物真菌病害，对病原真菌表现出极强的抑制作用[4-8]。

发酵动力学研究是为了解在发酵进程中菌丝体的生长、代谢产物生成和底物消耗的动态平衡及内在规律，为后续放大化提供理论基础[9，10]。迄今为止，国内外对多抗菌素发酵动力学的研究尚未见报道，因此研究多抗菌素的发酵动力学，将为多抗菌素后续规模化生产及发酵过程的调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌种是多抗菌素产生菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382，为课题组保存菌种。

培养基：①斜面培养基（g/L）：马铃薯200、蔗糖20、琼脂15～20、pH 7。②平板培养基（g/L）：同斜面培养基。③种子培养基（g/L）：蔗糖10、酵母膏10、KH2PO4 0.2、FeSO4 0.2、CaCO3 0.3、pH 6.0。④发酵培养基（g/L）：蔗糖20、酵母膏20、KH2PO4 0.2、FeSO4 0.2、CaCO3 0.3、pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 种子培养方法[11，12] 250 mL锥形瓶中装种子培养基50 mL，在摇瓶中接种菌株，培养温度为28 ℃，摇床转速180 r/min，培养48 h后接种至3 L发酵罐中进行发酵。

1.2.2 发酵罐培养 在3 L发酵罐中装入1 L优化后的培养基，经121 ℃灭菌21 min，冷却至室温，接入5%种子液，温度28 ℃，搅拌转速180 r/min，通气量3 L/min。

1.2.3 分析检测方法

1）蒽酮-硫酸法测定发酵液中蔗糖含量[13，14]。

A.标准曲线。配制0.1 mg/mL标准液，蒽酮试剂。取6支比色管，加入标准蔗糖、去离子水和蒽酮试剂，摇匀，沸水浴10 min，取出，冷却至室温，在620 nm波长下测定吸光度A。以标准蔗糖用量为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

B.样品测定。取1 mL发酵液，稀释250倍，分别加入溶剂和样品，摇匀，沸水浴10 min，取出，冷却至室温，在620 nm波长下测定吸光度A（以去离子水作空白对照），从标准曲线中查出蔗糖含量。

2）管碟法检测多抗菌素含量[15]。

A.标准曲线。将标准品分别稀释至200、800、 1 000、1 600、2 000、2 400 μg/mL不同浓度，使用管碟法（牛津杯法）测定不同浓度多抗菌素标准品的抑菌圈大小。以抑菌圈直径（mm）为横坐标、多抗菌素浓度（μg/mL）为纵坐标绘制标准曲线。

B.样品测定。使用管碟法测定样品抑菌圈大小，根据标准曲线测定多抗菌素含量。

3）测定菌丝体干重（DCW）。

取50 mL发酵液，4 ℃ 10 000 r/min，离心15 min，弃上清液，加入一定量去离子水洗涤2次，弃上清液，在80 ℃烘箱内烘干至恒重，减去离心管重量，即为菌丝体干重。

2 结果与分析

2.1 蔗糖标准曲线

根据试验结果，绘制图形如图1，得到标准曲线方程为y=7.957 14x-0.010 86。结果表明，线性相关系数R2=0.999 2，线性关系良好，用此法计算蔗糖浓度较为精准。

2.2 菌体生长动力学模型

本试验采用2种常见的菌丝体生长模型，即Logistic模型和Gompertz模型来模拟链霉菌菌丝体的生长情况，寻找最合适的模型。

2.2.1 Logistic模型 在描述微生物发酵过程中菌丝体的生长情况时，由比利时科学家Verhulst提出的Logistic方程[16，17]应用较为广泛，能够直观的显示在发酵过程中菌丝体的生长规律，Logistic方程为：

■=μm（1-■）X （1）

式中，X为菌丝体浓度（g/L）、Xm为最大菌丝体浓度（g/L）、t为发酵时间（d）。

发酵起始时间t=t0=0，X=X0，对（1）进行积分：

μmt=ln（■-1）+ln（■） （2）

或X=■ （3）

将试验数据拟合（图2），最终得出X0=0.688 7 g/L，Xm=2.903 0 g/L，μm=1.810 4 /d，R2=0.992 5，拟合较好。

2.2.2 Gompertz模型 Gompertz模型[18]用于描述微生物与时间变化之间的关系，其模型为：

■=r（ln■）X （4）

式中，X为菌丝体浓度（g/L）；Xm为最大菌丝体浓度（g/L）；r为比例系数。

对（4）式进行积分得：

X=A×exp{-exp[■（？姿-t）+1]} （5）

式中，λ为延滞期时间，即切线在x轴截距；A为渐近线值，即相对最大菌浓度（g/L）；e为常数2.718 28。

根据最小二乘法原理进行拟合，曲线见图3，得到A=2.906 9 g/L，μm=1.731 4 /d，λ=-0.147 4 /d，相关系数R2=0.989 9，模型适用性较好。

本试验分别引用Logistic模型和Gompertz模型来对链霉菌生长曲线进行模拟和描述。拟合结果表明，Logstic模型在链霉菌生长曲线的描述中拟合度最高。

2.3 多抗菌素合成动力学模型

采用Luededing-Piret[19]方程来描述链霉菌产物生成动力学模型：

■=？茁X+？琢■ （6）

式中，P为多抗菌素含量μg/mL，β、α为动力学相关系数。

发酵起始时间t=t0=0，P=P0，对（6）进行积分：

P=？琢X0（■-1）+？茁■ln1-■（1-e■）（7）

将试验数据代入（7）式进行拟合（图4），得出α=78.188 1，β=174.768 1，R2=0.894 2，模型的适用性良好。

通过方程拟合，得出α≠0、β≠0，发现多抗菌素发酵属于部分生长偶联型发酵，即菌体生长与产物合成相偶联，在发酵的对数期与稳定期都会有产物合成。

α为菌丝体生长相关系数，因此αμX为菌丝体生长对产物的贡献项；β为非菌丝体生长相关系数，则βX为非菌丝体生长相关项。图5表示随着时间的变化，菌丝体生长与非菌丝体生长项的变化规律。αμX项值从起始发酵到发酵终点均小于βX项。由此可知，菌丝体生长对多抗菌素的合成影响远没有非菌丝体生长因素（外界因素）对产量的贡献大。

2.4 底物消耗动力学模型

在多抗菌素发酵的过程中，底物的消耗一般用于維持微生物菌丝体正常生命代谢、微生物细胞的生长和各种代谢产物的合成。根据物料平衡守则，其动力学模型可用类似Luededing-Piret-Like方程表示：

-■=■■+■■+msX （8）

式中，S为底物浓度g/d；Yx/s为菌丝体生长的得率系数，g细胞/g底物；Yp/s为底物用于产物积累的得率系数，g产物/g底物；m为维持菌丝体代谢系数，g底物//g细胞·d）。

发酵初始条件下，t=0，X=X0、P=P0=0、S=S0，将式3和式7代入（8）式，积分得

S=S0-（■+■）×（■-X0）-（m+ ■）×■×ln■ （9）

将试验所得数据带入（9）式，进行数据拟合（图6），得到Yx/s =1.275 7×1025，Yp/s =1.567×105，m=0.888 0，R2=0.991 23，模型的适用性良好。

2.5 模型验证

对试验参数进行归纳见表1。在相同的发酵环境下重复进行3次试验，测定菌丝体干重、多抗菌素生成量、蔗糖消耗量。对发酵的试验测定值，利用（3）式、（7）式、（9）式作图（图7）。

2.6 模型总结

1）使用蒽酮-硫酸比色法建立蔗糖浓度的标准曲线，以此来对发酵过程中蔗糖浓度的变化进行实时测定。

2）本试验将Logistic模型和Gompertz模型用于描述菌丝体生长曲线，从中选择Logistic模型用于菌丝体生长的研究。利用Leudeking-Piret模型描述多抗菌素合成的动力学过程，发现该链霉菌生产多抗菌素的发酵类型属于部分生长偶联型，最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的动力学规律，结果表明这3个动力学模型均能较好的解释发酵试验结果，并对动力学模型参数进行了计算，为多抗菌素的放大化生产奠定相关理论基础。模型方程为：

■-1.810 4X（1-■）■=78.188 1■+174.768 1X-■=■■=■■+0.888X

3 小结与讨论

由建立的动力学模型可知，在第3天左右菌体的生长进入稳定期；由产物生成模型可知，菌丝体生长对多抗菌素贡献小，而非菌丝体生长因素（外界因素）对多抗菌素贡献显著；由底物消耗模型可知，底物用于菌丝体生长的系数Yx/s远大于底物用于产物生成的系数Yp/s，由此可知有大部分底物浪费在菌丝体生长上，而只有小部分底物参与产物合成。因此，为了降低流向菌丝体生长的能量，通过对发酵过程进行分阶段培养，以提高用于产物生成的能量比率。

温度对菌丝体生长有较大影响，温度过高抑制菌丝体生长，温度低，菌丝体生长缓慢。此外，温度还会对链霉菌发酵生产多抗菌素造成影响。对于同一种微生物，菌丝体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同，而由动力学模型分析可知，菌丝体的生长对产量贡献小，还会消耗用于产物合成部分的底物，因此，可在菌丝体生长达到一定浓度时，通过降低温度来减慢菌丝体的生长，从而为产物的生成节约能源。在多抗菌素的合成过程中，链霉菌丝体内各种酶相互协同参加反应，温度对酶的活性产生影响，采用多阶段控制体系的温度，可提高多抗菌素的产量。

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