鞘内注射Caspase—6抑制剂Z—VEID—FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响

殷智宇 楚帅帅 孙青 李璐 顾小萍 马正良

[摘要] 目的 研究鞘内注射Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响。 方法 采用小鼠右后足底皮内注射5%福尔马林溶液建立疼痛模型，32只小鼠根据随机数字表法分成四组：空白组、溶媒组、低剂量组和高剂量组，每组8只。空白组仅建立疼痛模型，溶媒组、低剂量组和高剂量组分别鞘内注射20%二甲基亚砜（DMSO）、5 μg Z-VEID-FMK和10 μg Z-VEID-FMK，給药体积为5 μL，随后建立疼痛模型。观察福尔马林炎性痛小鼠舔/咬脚时间，比较模型建立前及建立后60 min小鼠足底的厚度。 结果 各组小鼠足底皮内注射福尔马林后均出现明显的双时相疼痛反应，在一相痛中，低剂量组[（88.88±6.98）s]、高剂量组[（90.09±8.49）s]与溶媒组[（90.50±11.18）s]小鼠舔/咬脚时间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；在二相痛中，与溶媒组[（220.25±80.80）s]比较，低剂量组[（81.25±14.10）s]、高剂量组[（50.63±10.77）s]小鼠舔/咬脚时间均显著缩短，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与溶媒组[（1.78±0.02）mm]比较，低剂量组[（1.31±0.07）mm]及高剂量组[（1.11±0.08）mm]小鼠足底肿胀显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK可以缓解小鼠福尔马林炎性痛，可能与其抑制炎性因子作用有关。

[关键词] Caspase-6；Z-VEID-FMK；福尔马林炎性痛；足底厚度

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（c）-0031-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of intrathecal injection Caspase-6 inhibitor Z-VEID-FMK on mice with formalin inflammatory pain. Methods The pain model was established by subcutaneous injection 5% formalin in mouse′ right plantar. 32 mice were divided into four groups： control group， vehicle group， low-dose group， high-dose group according to random number table method， each group had 8 mice. Pain model was established only in control group. Vehicle group， low-dose group and high dose group was intrathecal injected 20% DMSO， 5 μg Z-VEID-FMK and 10 μg Z-VEID-FMK （the volume was 5 μL） respectively， followed by the establishment of pain model. The mice licking/biting foot time with formalin inflammatory pain was observed. Meanwhile， the foot thickness of mice before and 60 min after establishment of formalin pain model was compared. Results All mice displayed apparent dual-phase pain response after subcutaneously injected formalin. In phase-1， there were no significant differences on mice licking/biting foot times among low-dose group [（88.88±6.98） s]， high dose group [（90.09±8.49） s] and vehicle group [（90.50±11.18） s] （P > 0.05）. In phase-2， compared with vehicle group [（220.25±80.80） s]， mice licking/biting foot times of low-dose group [（81.25±14.10） s] and high-dose group [（50.63±10.77） s] were significantly shorten， with statistical differences （P < 0.01）. Compared with vehicle group [（1.78±0.02） mm]， plantar thickness of mice in low-dose group [（1.31±0.07） mm] and high-dose group [（1.11±0.08） mm] were significantly reduced， with statistical differences （P < 0.01）. Conclusion Caspase-6 inhibitor Z-VEID-FMK can relieve formalin inflammatory pain and may be related to its anti-inflammatory effect.

[Key words] Caspase-6； Z-VEID-FMK； Formalin inflammatory pain； Plantar thickness

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cystein-containing aspartate-specific protease，Caspase）是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，在调节细胞凋亡、神经退行性变及炎性反应中有着重要的作用[1]。已有研究表明，Caspase家族中的Caspase-1和Caspase-3通过调节白介素（IL）-1β和神经元凋亡参与神经病理性疼痛的发生、发展[2]。Caspase-6属于效应Caspase分子，存在于神经元轴突中，与神经元轴突退行性变密切相关，在老年个体中，Caspase-6与阿尔兹海默病（AD）病理学及记忆力下降密切相关[3]，以往研究主要集中于AD等神经变性疾病及肿瘤方面作用[4-5]，但在其他领域研究较少。Caspase-6在大脑组织和外周组织中有广泛表达[6-7]。有实验研究显示，Caspase-6蛋白存在于脊髓背角[8]，因此，推测Caspase-6参与了脊髓疼痛信号传递。本实验拟通过观察鞘内注射Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响，初步探求Caspase-6在炎性疼痛中的作用，为进一步验证Caspase-6参与脊髓疼痛信号传递提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只健康成年雄性ICR小鼠，6～8周，体重30～35 g，由扬州大学比较医学中心提供[动物合格证号：SKXK（苏）2012-0004]。饲养环境室温控制在20～24℃，小鼠自由饮食，待适应环境5 d后用于实验。

1.2 实验分组

采用随机数字表法将小鼠分为空白组、溶媒组、低剂量组（5 μg Z-VEID-FMK）及高剂量组（10 μg Z-VEID-FMK），每组8只小鼠。空白组小鼠不注射药物，溶媒组小鼠鞘内注射20%二甲基亚砜（DMSO），低剂量组小鼠鞘内注射5 μg Z-VEID-FMK，高剂量组小鼠鞘内注射10 μg Z-VEID-FMK。给药后10 min，小鼠右后足底皮内注射5%福尔马林溶液建立福尔马林炎性痛模型。研究遵循有关实验动物保护和使用的指南，并经单位实验动物伦理委员会批准。

1.3 实验方法及观察指标

1.3.1 实验仪器及材料 Z-VEID-FMK（Caspase-6抑制剂，Sigma公司），DMSO（北京舒伯伟化工仪器有限责任公司），甲醛溶液（36%～37%，Sigma公司），千分尺（Deshen，中国，0.01 mm）。Z-VEID-FMK首先溶解于DMSO中，随后用生理盐水（NS）稀释，最终溶剂浓度20%DMSO。取0.5 mL的甲醛溶液稀释于9.5 mL的NS中，配成5%的福尔马林溶液。

1.3.2 小鼠鞘内注射方法 按压小鼠腰骶两侧固定，自L4～L5棘突间进针，以鼠尾突然出现侧向运动为注射成功标志。用微量进样器进行注射，注射药物容积为5 μL，注射时间10 s，留针10 s。

1.3.3 福尔马林炎性痛模型制作及疼痛测定 福尔马林实验根据Hunskaar等[9]描述的方法进行，具体方法是将小鼠单独置于玻璃烧杯中，使其适应环境30 min，鞘内注射药物或溶媒后10 min，先固定小鼠，消毒小鼠右后肢，在右后足足底中部皮内注射25 μL的5%福尔马林溶液，使其局部产生红、肿、热、痛等炎性反应，随后将小鼠放置于烧杯中，在烧杯底下放一面镜子以便清晰观察小鼠的右后爪，用秒表记录每5分钟小鼠舔/咬脚的时间作为疼痛的指标。

1.3.4 足底肿胀程度测定 根据Winter等[10]所描述的方法，测量小鼠福尔马林足底肿胀厚度，作为药物抗炎作用的指标。小鼠足底皮内注射福尔马林（5%，25 μL）后注射部位产生水肿，测量福尔马林注射前和注射后60 min足背-足底轴的厚度。肿胀程度计算：Δ肿胀=V2-V1（V1：足底注射福尔马林前的厚度；V2：足底注射福尔马林后的厚度）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量方差分析或单因素方差分析，两两比较采用post hoc分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鞘内注射Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛舔/咬脚时间的影响

小鼠模型建立后，0～5 min产生显著的一相痛反应，静息期无显著疼痛反应；10～45 min产生显著的二相痛。整体分析显示：组间比较（F = 59.053，P < 0.01）、时间点比较（F = 157.037，P < 0.01）、分组与时间的交互作用比较（F = 5.209，P < 0.01）差异均有统计学意义。精细比较：空白组与溶媒组各个时间点的两两比较差异无统计学意义（P > 0.05）；福尔马林注射后15～35 min，溶媒组、低剂量组、高剂量组两两比较，小鼠舔/咬脚时间差异均有统计学意义（P < 0.05）；低剂量组及高剂量组舔/咬脚时间均短于空白组及溶媒组（P < 0.05），且高剂量组舔/咬脚时间短于低剂量组（P < 0.05）。见图1。

在一相痛中，四组小鼠舔/咬脚时间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；在二相痛中，与空白组及溶媒组比较，低剂量组小鼠舔/咬脚时间显著缩短，差异有高度统计学意义（P < 0.01），高剂量组小鼠舔/咬脚时间显著缩短，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。低剂量组与高剂量组两两比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），说明Z-VEID-FMK抑制小鼠福尔马林炎性痛反应的效果呈剂量依赖性。见表1。

2.2 鞘內注射Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛模型足底肿胀的影响

注射福尔马林后，小鼠足底产生明显红肿，空白组及溶媒组小鼠的足底肿胀值分别为（1.78±0.04）、（1.78±0.02）mm，差异无统计学意义（P > 0.05）。与溶媒组比较，低剂量组[（1.31±0.07）mm]、高剂量组[（1.11±0.08）mm]小鼠足底肿胀值显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

3 讨论

Caspase成员具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性，通常以酶原的形式存在。按效应可分为两类：一类是上游启动者Caspases，如Caspase-8、9，可裂解并激活其他Caspase；另一类是下游效应者Caspases，主要包括Caspase-3、6、7，可裂解各种底物，分解细胞结构或使酶失活[11]。近年来，Caspase-6的重要作用逐渐被研究者发现，除了参与细胞凋亡外，在神经退行性变、免疫炎症、肿瘤、增殖等方面均有重要的作用。

足底皮内注射福尔马林是一个经典的炎性痛模型，本实验小鼠注射福尔马林后，注射足表现出缩腿、舔爪及颤抖等反应，对伤害性刺激的行为学反应的表现分为两个不同的时间段，与文献报道一致，说明福尔马林小鼠致痛模型的复制是成功的[12]。一相痛为0～5 min，主要与福尔马林对外周C纤维的直接刺激及神经末梢释放致痛物质有关，属于非炎性痛；二相痛为10～45 min，主要由外周及脊髓的炎性因子[例如IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α等]释放产生，属于炎性痛[13-14]。总的来说，中枢性镇痛药可以抑制一相痛及二相痛，外周性镇痛药只能抑制二相痛[15]。溶媒组与空白组比较差异无统计学意义，说明鞘内注射溶媒不影响小鼠疼痛行为。本研究结果显示，鞘内注射Z-VEID-FMK对小鼠一相痛没有显著影响，但是剂量依赖性地抑制二相痛，说明Caspase-6主要参与了福尔马林炎性痛的中枢敏化及炎性反应的过程。傅开元等[16]研究发现，大鼠足底皮内注射福尔马林引起的炎性损伤可以导致脊髓角Fas/Fas-L途径的神经元凋亡。Woolf等[17]研究发现，在外周神经损伤的大鼠神经病理性疼痛模型中，脊髓背角浅层神经元发生凋亡后留下空隙，脊髓深层未受到损伤的神经纤维可通过芽生的方式，使轴突伸入脊髓背角浅层，与浅层的伤害性神经元构成新的突触联系，使伤害性刺激信息传导通路发生异常放电，引起神经兴奋性升高，产生痛觉过敏或痛觉异常。Moore等[18]研究报道，外周损伤引起脊髓后角凋亡的神经元可能为抑制性中间神经元，而抑制性中间神经元的减少使脊髓后角传导痛觉的伤害性神经元异常兴奋，可表现为痛觉过敏。吴飞翔[19]研究显示，与Caspase-6同为Caspase效应酶的Caspase-3可通过增加TNF-α的表达从而增加细胞凋亡产生神经病理性疼痛，因此推测Caspase-6或许通过增加炎症介质（IL-1β、TNF-α）释放、活化胶质细胞、诱导神经元凋亡等参与福尔马林炎性疼痛过程，具体机制仍有待进一步研究。

本实验结果还显示，鞘内注射Z-VEID-FMK可以剂量依赖性地抑制福尔马林导致的小鼠足底肿胀。福尔马林引起的足底局部组织水肿与某些炎症介质如组胺、缓激肽等介导血管扩张与渗出有关[20]，在炎症状态下神经末梢会分泌P物质等神经介质，促进局部血管扩张，增加渗出，加重局部组织肿胀。抑制神经末梢某些促炎性因子（IL-1β、TNF-α）或神经介质（P物质）的释放可能是鞘内注射Z-VEID-FMK抑制足底肿胀的机制。

综上所述，Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK可以缓解小鼠福尔马林炎性痛，减轻小鼠足底肿胀，可能与其抑制炎性因子作用有关。

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（收稿日期：2015-12-06 本文编辑：李亚聪）