胃癌组织中节律基因Period1和Period2的表达变化及意义

王兰芳，林娟，王小敏

(1海口巿中医院,海口570203；2海南省中医院)



胃癌组织中节律基因Period1和Period2的表达变化及意义

王兰芳1，林娟2，王小敏1

(1海口巿中医院,海口570203；2海南省中医院)

目的观察节律基因Period1和Period2在胃癌组织中的表达变化，并探讨其临床意义。方法 选择138例胃癌患者，术中留取胃癌及癌旁组织，采用免疫组化法检测胃癌及癌旁组织中的Period1和Period2，实时荧光定量PCR法检测胃癌及癌旁组织中的Period1和Period2 mRNA。结果胃癌组织中Period1和Period2阳性表达率分别为23.2%、31.2%，均低于癌旁组织中的44.9%、64.5%(P均<0.01)；胃癌组织中Period1 mRNA和Period2 mRNA相对表达量分别为1.05±0.10、1.09±0.12，均低于癌旁组织中的1.31±0.13、1.47±0.16(P均<0.01)；Period1 mRNA表达与胃癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移和Lauren分型有关(P均<0.05)，Period2 mRNA表达与胃癌组织分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和Lauren分型均有关(P均<0.05)；相关性分析显示，胃癌组织中Period1与Period2表达呈正相关(r=0.285，P<0.05)，Period1 mRNA与Period2 mRNA表达呈正相关(r=0.379，P<0.05)。结论 胃癌组织中节律基因Period1和Period2呈低表达，可能在胃癌的发生、发展中起重要作用。

胃癌；节律基因；Period1；Period2

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，患者早期多无明显症状或症状轻微，易错过最佳的治疗时机，多数患者临床确诊时已处于晚期，预后不佳[1]。因此，早期发现胃癌患者对改善患者预后具有重要意义。研究表明[2]，胃癌发生及进展过程涉及多种癌基因和抑癌基因的相互作用及由此而导致的一系列细胞生物学行为变化。研究发现[3]，生物钟节律在维持正常生物节律及细胞增殖、凋亡周期中发挥重要作用。生物节律一旦发生改变，可导致睡眠时相提前综合征、季节性情感钟爱、肿瘤等疾病的发生[4]。Period1和Period2是重要的生物节律基因，在调节生物钟节律中发挥重要作用。有研究发现，将小鼠Period基因敲除后，其肿瘤发生及细胞增殖和异型性变化显著增加[5]。有研究发现[6]，Period1和Period2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等恶性肿瘤中异常表达。但是，有关节律基因在胃癌发生、发展中的作用鲜有报道。本研究观察了Period1和Period2在胃癌组织中的表达变化，探讨二者在胃癌发生及进展中的意义。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2012年2月～2015年8月在海口市中医院择期行手术切除治疗的胃癌患者138例，其中男81例、女57例，年龄(59.8±9.5)岁。所有患者术前未接受放化疗，术后经病理学检查确诊；肿瘤位于胃体部59例，胃底和贲门部69例；肿瘤最大径≥5 cm 54例，<5 cm 84例；组织分化程度：低分化75例，中分化34例，高分化29例；浸润深度：黏膜及黏膜下层21例，肌层25例，浆膜层92例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期85例；Lauren分型：弥漫型61例，肠型77例；发生淋巴结转移83例。术中均留取患者胃癌组织及癌旁>5 cm的正常胃组织，-70 ℃液氮中保存以备检。

1.2主要试剂与设备兔抗人Period1多克隆抗体购自美国Abcom公司，兔抗人Period2多克隆抗体购自美国Abnova公司；TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自大连博瑞得生物公司，Period1、Period2及其内参引物均由上海生工公司设计并合成，MaxVision2/HRP试剂盒购自福建迈新生物技术公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3胃癌及癌旁组织中Period1和Period2检测采用免疫组化法。取胃癌及癌旁组织，于4%甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、脱蜡；用3% H2O2浸泡15 min，PBS冲洗3次；用胰蛋白酶消化10 min，用PBS冲洗3次；将兔抗人Period1、Period2多克隆抗体(PBS代替一抗作为阴性对照)加入，室温下孵育60 min，PBS冲洗3次；将多聚酶标二抗加入，室温下孵育15 min，PBS冲洗3次；用DAB显色5 min，水洗、复染、脱水、透明、封片、观察。结果判定：于100倍光学显微镜下选取结构良好、背景清晰的5个视野，高倍镜下每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞率。阳性细胞率<25%为1级，25%～﹤50%为2级，50%～﹤75%为3级，≥75%为4级；1级为阴性，2～4级为阳性。

1.4胃癌及癌旁组织中Period1和Period2基因检测采用实时荧光定量PCR法。取胃癌及癌旁组织，研磨后用细胞裂解液裂解；用TRIzol总RNA提取试剂盒提取组织的总RNA，并检测纯度，取A260/A280≥1.80标本完成后续实验。利用逆转录试剂盒逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板利用PCR试剂盒完成PCR。Period1、Period2和内参引物：Period1上游引物5′-CCCACCCCACCAGCCACTAC-3′，下游引物5′-CCTGTGCCGGAGCGCGAGTC-3′； Period2上游引物5′-ATCTCTGACCAGGTTGCATC-3′，下游引物5′-CCAGAGTGCACTCTCTCTGC-3′；内参GAPDH上游引物5′-CCAAAATCAGATGGGGCAATGCTGG-3′，下游引物5′-TGATGGCATGGACTGTGGTCATCA-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；92 ℃ 60 s，92 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，连续进行40个循环后终止反应。每个样品均设置3个平行反应复孔，用2-ΔΔCt法获得胃癌及癌旁组织中Period1和Period2基因相对表达量。

2　结果

2.1胃癌及癌旁组织中Period1和Period2表达比较胃癌组织中Period1和Period2阳性表达率分别为23.2%(32/138)、31.2%(43/138)，均低于癌旁组织中的44.9%(62/138)、64.5%(89/138)，差异均有统计学意义(P均<0.01)。

2.2胃癌及癌旁组织中Period1和Period2基因表达比较胃癌组织中Period1 mRNA和Period2 mRNA相对表达量分别为1.05±0.10、1.09±0.12,均低于癌旁组织中的1.31±0.13、1.47±0.16，差异均有统计学意义(P均<0.01)。

2.3Period1和Period2基因表达与胃癌临床病理特征的关系胃癌组织中Period1 mRNA表达与胃癌患者的年龄、性别及肿瘤最大径、肿瘤位置和TNM分期均无关(P均>0.05)，而与分化程度、浸润深度、淋巴结转移和Lauren分型有关(P均<0.05)；Period2 mRNA表达与胃癌患者的年龄、性别及肿瘤最大径、肿瘤位置均无关(P均>0.05)，而与肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和Lauren分型有关(P均<0.05)。见表1。

表1　Period1和Period2基因表达与胃癌临床病理特征的关系

2.4胃癌组织中Period1和Period2表达的关系胃癌组织中Period1与Period2表达呈正相关(r=0.285，P<0.05)，Period1 mRNA与Period2 mRNA表达呈正相关(r=0.379，P<0.05)。

3　讨论

胃癌作为消化系统较为常见的恶性肿瘤，由于目前尚无有效的早期检测手段，且肿瘤恶性程度高、侵袭及转移能力强，多数患者预后不佳。因此，胃癌的相关发生机制一直是临床研究热点。近年相关研究发现[7]，机体正常生理活动具有节律性，这种节律模式受机体节律基因的调控。节律基因在调控细胞增殖周期和凋亡、器官功能中发挥重要作用，同时，亦可影响肿瘤细胞的生长、转移、侵袭过程[8]。Period1和Period2是维持正常机体节律所必需的节律基因，越来越多的研究发现二者也是潜在的抑癌基因。Period1表达上调可通过激活癌细胞DNA损伤而诱导细胞凋亡发生[9]，与乳腺癌[10]、前列腺癌[11]等恶性肿瘤的发生有关；Period2过表达可导致细胞分化减少并加速凋亡发生，亦可通过重置细胞周期阻滞细胞在G2/M期而影响细胞周期进程[12]。本研究免疫组化检测结果显示，胃癌组织中Period1和Period2阳性表达率均低于癌旁组织；实时荧光定量PCR检测结果显示，胃癌组织中Period1 mRNA和Period2 mRNA相对表达量均低于癌旁组织。说明Period1和Period2在胃癌组织中呈低表达，可能在胃癌发生中发挥抑癌基因的功能。

本研究结果显示，Period1 mRNA表达量与胃癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移和Lauren分型有关，即分化程度越高、浸润深度越浅、不发生淋巴结转移及Lauren分型弥漫型，Period1表达水平越高。说明Period1基因可能与胃癌发生及细胞侵袭、转移性有关，Period1表达受抑制可减少细胞凋亡发生、增强肿瘤细胞侵袭性[13]。本研究显示，Period2 mRNA表达量与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和Lauren分型有关(P均<0.05)，说明Period2亦与胃癌细胞侵袭、转移性有关；Period2低表达可加速胃癌进展，可能与其低表达加速细胞周期进程有关[14]。相关分析结果显示，胃癌组织中Period1表达与Period2表达呈正相关，说明节律基因Period1与Period2可能发生协同作用而促进胃癌发生及进展过程。

综上所述，Period1和Period2在胃癌组织中呈低表达，可能与肿瘤发生及转移、侵袭性有关，但具体作用机制尚待进一步从细胞、分子水平予以深入研究明确。

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