木薯茎杆基质比例对3 种食用菌海藻糖含量的影响

王琴飞，蔡　坤，林立铭，羊贤月，张振文*

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，国家薯类加工技术专业分中心，海南 儋州 571737）

木薯茎杆基质比例对3 种食用菌海藻糖含量的影响

王琴飞，蔡坤，林立铭，羊贤月，张振文*

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，国家薯类加工技术专业分中心，海南 儋州 571737）

以木薯茎杆栽培的食用菌为试材，对海藻糖的提取方法和高效液相色谱-蒸发光散射（high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD）检测方法进行优化，分析不同比例木薯茎秆栽培3 种食用菌（黑木耳、平菇、榆黄蘑）海藻糖含量。结果表明，食用菌中的海藻糖在80 ℃水浴60 min条件下可有效提取，最高含量达到190.5 mg/g；利用优化后色谱条件分析标准品和样品中海藻糖，其分离效果均良好。并分析黑木耳、平菇和榆黄蘑中海藻糖含量，发现当栽培基质的木薯茎秆比例为31.2%时，3 种食用菌海藻糖含量较高，分别为61.5、250.3 mg/g和15.0 mg/g。结果表明，HPLC-ELSD可分析3 种食用菌中海藻糖含量，方法准确度高、重复性好、样品稳定性较好；3 种食用菌海藻糖含量与培养基质中木薯茎秆比例有关，合适的木薯茎秆比例可提高食用菌中海藻糖含量。

木薯茎秆；食用菌；海藻糖；高效液相色谱-蒸发光散射

木薯是三大薯类作物（马铃薯、番薯、木薯）之一，具有生物产量高，抗逆性强、耐贫瘠等优点，是目前淀粉和生物能源生产的重要原料［1］。目前，人们主要是利用木薯地下块根，而地上部分的木薯茎杆一直被人们认为是采收后产生的废弃物。研究者通过木薯茎杆直接粉碎还田可提高土壤肥力和提高鲜薯的产量，但利用率存在一定的局限性；也有研究人员将木薯杆中纤维素水解后进一步用于酒精、有机酸和抗生素的生产，但生产成本较高，很难得到广泛的应用［2］。木薯茎杆质地疏松，经检测含粗蛋白5.1%、粗纤维23.3%、碳水化合物45.5%，适合用于栽培食用菌［3］。因此，研究者应用木薯茎杆代替传统原料棉籽壳，成功的栽培出杏鲍菇［3］、秀珍菇［4］和金福菇［5］等，延长了木薯行业的产业链，但研究仅对栽培配方的进行了比较，并未对食用菌中的功能性成分进行分析。

食用菌富含蛋白质，多种维生素，矿物质和膳食纤维，被认为是一种低热量食物，近年来研究发现，大部分食用菌中都含有海藻糖，并且双糖海藻糖是菇类风味成分的组成之一［6］，在工业上常用于食物、生物材料和疫苗的低温保鲜等，与生物抗逆耐受力具有直接关系［7-10］，在植物中可作为一种抗逆代谢产物存在并发挥作用［11-12］。检测海藻糖的方法很多，有纸层析［13］、薄层层析［14］、气相色谱法［15-16］、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［17］、蒽酮-硫酸比色法［18］和酶分析法［19］等，各种方法都存在一定的缺陷。其中纸层析、薄层层析、蒽酮-硫酸法分析灵敏度较低，操作繁琐，杂质干扰较大，准确度和重复性较差以至于不能准确定量。气相色谱法需要衍生化后进行分析，操作繁琐。酶分析法成本较高，操作复杂。HPLC法是海藻糖和单糖等定性定量分析的常用手段［20］，但由于示差折光检测器的灵敏度较低［21］，在食用菌中应用较少，研究者常利用高效阴离子色谱-脉冲安培检测法检测食用菌中海藻糖和单糖的含量，能得到较好的结果［6，22］。蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）作为一种新型的通用型检测器在HPLC上的应用，使HPLCELSD快速测定食用菌中海藻糖及单糖含量成为可能。本研究以木薯茎秆栽培的食用菌为实验材料，通过不同提取方法的比较，期望获得食用菌中海藻糖的最佳提取条件，并在前人的研究基础上，建立3 种食用菌中海藻糖含量的HPLC-ELSD方法，对不同比例木薯茎秆栽培的3 种食用菌中海藻糖进行检测评价，为木薯茎杆的综合利用提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

木薯茎秆 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家薯类加工技术研发分中心；平菇、榆黄蘑和黑木耳菌株，菌种来自于吉林农业大学。

海藻糖标准样品（纯度≥98%）、乙腈（色谱纯）美国Sigma公司；超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）由Elix3+Synergy超纯水系统制备。

1.2仪器与设备

1260型LC系统（配备四元泵、自动进样器、蒸发光检测器和柱温箱） 美国Agilent公司；Elix3+Synergy超纯水系统 美国Millipore公司；KQ-400KDE超声波清洗器 江苏昆山市超声仪器有限公司；HVE-50灭菌锅日本Hirayama公司；HWS-26水浴锅 上海一恒仪器设备有限公司。

1.3方法

1.3.1食用菌的培养

木薯茎秆收获后，经晒干、粉碎备用，使用前1 d重新翻晒一次。木薯茎杆与木屑按表1配方混匀，水的用量根据基料的湿度而定，基质与水的比例为1∶1.2或1∶1.5（g/g），搅匀后再根据表1配方比例加入麦皮、石灰、石膏后，再按基质与水1∶0.5比例加水搅匀，使基料含水量为（58±2）%（手轻捏培养料有水渗出，但不外滴为准），装袋，灭菌。将灭菌后的培养袋和接种工具放入超净工作台分别接种。接种后根据牛长满［23］的方法进行发菌、培养和采收。采收后先自然晾干，再用烘箱70 ℃烘干至恒质量，利用植物样品粉碎机粉碎，并过100 目钢筛，于4～8 ℃保存备用。食用菌栽培基质配方见表1。

表1　食用菌栽培基质配方Table1　Substrate formulations for cultivating edible fungi%

1.3.2海藻糖的提取与检测

提取条件：分别称取3 种食用菌样品粉末0.100 g于50 mL离心管，加25 mL去离子水，混匀，在恒温水浴锅中加热提取60 min（温度80 ℃）。提取后放入4 ℃冰箱，待冷却后12 000×g离心20 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC分析。每个样品设3 个重复。

色谱条件：COSMOSIL Sugar-D色谱柱（4.6mm× 250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相为乙腈-水（70∶30，V/V）溶液，流速1.0 mL/min；进样量10 μL；漂移管温度85 ℃；雾化温度70 ℃；气流速率1.6 L/min；分析时间10 min；以外标法计算试样中海藻糖的含量。

1.3.3标准溶液的配制

分别精确称取0.100 g海藻糖，用体积分数50%乙腈溶液溶解并定容到100.0 mL，配制成10.0 mg/L标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.4数据处理

采用Microsoft Excel 2013进行数据分析和制图，采用SPSS 22.0统计软件进行显著性分析。

2　结果与分析

2.1海藻糖检测方法的优化

参照文献［24］方法，根据流动相的种类和比例，首先设定漂移管温度为80 ℃，氮气流速为2.0 L/min。保持气速不变，用100 mg/L的标准品混合溶液进样，在70～95 ℃范围内改变漂移管温度，观察信号基线水平和噪音，信噪比呈先降低后升高的趋势，基线都较平稳，当漂移管温度为85 ℃时，流动相基本挥发，信噪比最低。固定漂移管温度为85 ℃，观察1.4～2.0 L/min不同氮气流速时海藻糖的信号强度，1.6 L/min为在较小噪音水平上，产生最大检测响应值的最低气速。故选定漂移管温度85 ℃，氮气流速1.6 L/min。以优化的检测条件，对标准品和样品中的海藻糖进行分析，如图1所示，标准品种中海藻糖的保留时间为6.976 min，样品中保留时间为7.976 min，保留时间一致。标准样品和样品中峰形较好，没有拖尾现象。

图1　标准样品（A）和样品（B）海藻糖HPLC图Fig.1　HPLC-ELSD chromatograms of trehalose standard （A） and real sample （B）

2.2海藻糖提取条件的优化

通过不同时间80 ℃水浴和超声处理（超声温度40～60 ℃，超声频率3 200 kHz）提取比较发现，在相同的时间内（1 h），80 ℃水浴提取效率更高，海藻糖含量达到了190.5 mg/g，比超声提取提高了53.2 mg/g。从图2a可以看出，在水浴提取的过程中，海藻糖含量在不断增加，以水浴60 min和120 min时提取效果最佳，含量分别达到了190.5 mg/g和193.8 mg/g，在此期间海藻糖含量变化不显著；虽然30 min时海藻糖含量与60 min最高含量差异不显著，但与120 min相比却达到了显著水平，两者相差5.5 mg/g，结果表明，水浴60～120 min时是海藻糖提取的最佳时间段；由图2b可知，随着超声处理时间的延长海藻糖含量增加，实验中还发现，超声提取温度会随着时间的延长而升高，温度从30 ℃升高到50 ℃，温度很难控制，由此可知，海藻糖的提取可能与温度有关。因此，选择水浴60 min提取，可以较好地控制提取温度和有效提取海藻糖。

图2　80 ℃水浴（a）和超声处理（b）对样品中海藻糖含量的影响Fig.2　Effects of hot water bath extraction at 80 ℃ （a） and ultrasonic extraction （b） on trehalose contents in samples

2.3HPLC-ELSD检测方法的验证

2.3.1线性关系、检出限和定量限考察

用体积分数50%乙腈溶液稀释海藻糖的标准储备液，配制成5～200 mg/L的5 个梯度标准溶液，在1.3.2节色谱条件下，依次进样10 μL，根据ELSD测得的峰面积（Y）与相应的标准溶液质量浓度（X，mg/L）进行线性回归，发现线性很差。参照文献［25］方法，以海藻糖质量浓度的对数（lgX）与ELSD测得的峰面积的对数（lgY）进行线性回归分析，得到回归方程为lgY=1.330 4lgX-0.010，两者间存在着良好的线性关系，海藻糖的线性相关性系数（R2）达到了0.999 7。将最小浓质量度的标准溶液再逐级稀释，依次进样10 μL，计算3 倍信噪比和10 倍信噪比对应的标准溶液质量浓度，以确定检出限和定量限，海藻糖检出限为0.06 mg/L，定量限为0.15 mg/L。

2.3.2仪器精密度、样品稳定性结果

以100 mg/L海藻糖标准品连续进样6 次，每次进样体积为10 μL，按照上述色谱条件进行分离检测，计算峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察仪器的精密度，海藻糖的峰面积分别为422.7、394.3、392.6、387.5、422.7、404.0，RSD为3.8%，证明仪器精密度较好；取任意一样品溶液，每隔1 h进样1 次，按照色谱条件测定峰面积，计算6 h内样品中海藻糖的含量，其海藻糖含量分别为218.2、216.1、215.6、208.6、208.7、208.9 mg/g，RSD为2.1%，表明样品在6 h内稳定性较好。

2.3.3回收率实验结果

取1.3.1节获得的食用菌样品12 份，每个样品0.100 g，取9 个样品加入25 mL水后，分别加入3 个质量浓度梯度的海藻糖标准溶液；另外3 个样品不加入海藻糖标准样品作为对照。所有样品按照1.3.2节过程提取样品中的海藻糖，进行回收率实验，每梯度设置3 个重复。样品中海藻糖的平均回收率为97.4%，RSD为0.7%。结果见表2，样品中海藻糖加标回收率较好，方法准确度较高，可用于实际样品的测定。

表2　方法的回收率结果Table2　Recovery of the method

2.4木薯茎秆培养的食用菌中海藻糖含量测定

利用实验中建立的海藻糖的提取和检测方法，对1.3.1节中不同木薯茎秆作为基质培养的3 种食用菌中海藻糖的含量进行分析。由表3可知，3 种食用菌中都含有海藻糖，其中以平菇中海藻糖含量最高，含量达到了250.3 mg/g，榆黄蘑中含量最低，含量为16.6 mg/g；通过显著性分析可知，木薯茎秆比例为31.2%时，栽培的黑木耳、平菇和榆黄蘑的海藻糖含量最佳，分别为61.5、250.3 mg/g和15.0 mg/g，黑木耳和榆黄蘑与其他比例木薯茎秆栽培的含量达到显著差异；榆黄蘑在木薯茎秆比例分别为15.6%、31.2%、62.4%和78.0%时，海藻糖含量差异不显著，但与未使用木薯茎秆栽培基质相比，有显著差异。由此可知，栽培基质可影响食用菌中海藻糖含量，选择合适的木薯茎秆比例，可以提高食用菌中海藻糖的含量。

表3　不同比例木薯茎秆栽培对3 种食用菌中海藻糖含量的影响Table3　Effect of cultivation with different ratios of cassava stalk on trehalose contents in three edible fungi

3　讨论与结论

HPLC法检测样品中单糖或多糖，通常用糖分析柱、氨基键合柱或C18柱作固定相，以乙腈和水的混合溶剂或纯水为流动相来分析，氨基柱在分析的过程中需要在水中加入0.1% NH4OH，而C18柱在水相中稳定性较差，因此，实验采用糖分析柱，并且，糖分析色谱柱在海藻糖的测定已得到广泛的应用［26-27］。在利用HPLC-ELSD进行糖分析时，全部柱流出物都进入ELSD的漂移管，让流动相在其中蒸发，如果采用纯水做流动相，ELSD就必须采用较高的漂移管温度和较大的雾化器载气流速才能有利于蒸发，这使得ELSD检测的峰面积减小，降低了灵敏度。故本实验采用沸点较低的乙腈为流动相。

文献［22］报道，常温很难让海藻糖从细胞壁上解离，海藻糖的提取温度一般都在60～80 ℃，在提取方法优化中发现，水浴和超声都可以提高海藻糖的含量，但是超声提取温度会随着时间的延长而升高，温度很难控制，提取60 min可使温度从30 ℃提高到50 ℃，海藻糖提取含量也未达到最高。在刘海燕等［22］的研究结果表明，温度可影响海藻糖的提取率，为了提取效果达到一致性，实验选择80 ℃水浴提取3 种食用菌中海藻糖。在进行海藻糖定量分析中发现，根据ELSD测得的峰面积与相应的标准溶液质量浓度进行线性回归，发现线性很差，而海藻糖质量浓度的自然对数与ELSD测得的峰面积的自然对数进行线性回归分析，两者间才能得到良好的线性关系，结果与文献［25］报道一致。

通过分析不同比例木薯茎秆栽培的3 种食用菌中海藻糖，黑木耳、平菇和榆黄蘑中的海藻糖含量丰富，以海藻糖的最高值相比，黑木耳占干样的百分比达到了6.2%，比文献［6］报道的有明显提高。海藻糖含量呈现平菇＞黑木耳＞榆黄蘑的趋势；并且海藻糖含量的高低与食用菌的种类及培养基质比例有直接关系。结果表明，木薯茎秆比例为31.2%时，平菇、榆黄蘑和黑木耳中海藻糖含量较高，但从文献［28］报道发现，木薯茎秆在栽培杏鲍菇金福菇［5］和秀珍菇［4］时，栽培的最佳配方中木薯茎秆基质的比例分别为80%、83%和45%，证明不同的食用菌使用的比例不同。因此，在提高食用菌中海藻糖含量的同时，还应保证食用菌的出菇率，分析食用菌中氨基酸、维生素和其他的营养指标，才能综合评价木薯茎秆栽培3 种食用菌的最佳比例。

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Effect of Cassava Stalk Substrate Ratio on Trehalose Content in Three Cultivated Edible Fungi

WANG Qinfei， CAI Kun， LIN Liming， YANG Xianyue， ZHANG Zhenwen*
（National R&D Centre for Patato Processing， Tropical Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， China）

In this study， an optimized method using high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） was developed for detecting trehalose extracted from three edible fungi including Auricularia auricula-judae， Pleurotus ostreatus， and Pleurotus citrinopileatus Sing.， which were cultivated on mixed substrates containing assava （Manihot esculenta） stalk. The relationship between trehalose content and cassava stalk proportion was explored. The results indicated that the trehalose in edible fungi could be completely extracted in 80 ℃ water bath in 60 minutes， and the maximum yield of trehalose could reach 190.5 mg/g. Under the optimized chromatographic conditions，good separation of trehalose and maximum contents of trehalose were obtained from edible fungi cultivated on a substrate with 31.2% cassava stalk， which were 61.5， 250.3 and 15.0 mg/g for Auricularia auricula-judae， Pleurotus ostreatus，and Pleurotus citrinopileatus Sing.， respectively. This study has demonstrated that the trehalose content of edible fungi can be accurately and conveniently determined by HPLC-ELSD. In addition， the trehalose contents of A. auricula-judae，P. ostreatus and P. citrinopileatus can be significantly improved by cultivating them on a substrate with a proper ratio of cassava stalk.

cassava stalk； edible fungi； trehalose； high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD）

10.7506/spkx1002-6630-201618017

S533

A

1002-6630（2016）18-0102-05

王琴飞， 蔡坤， 林立铭， 等. 木薯茎杆基质比例对3 种食用菌海藻糖含量的影响［J］. 食品科学， 2016， 37（18）: 102-106. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618017. http://www.spkx.net.cn

WANG Qinfei， CAI Kun， LIN Liming， et al. Effect of cassava stalk substrate ratio on trehalose content in three cultivated edible fungi［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 102-106. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618017. http://www.spkx.net.cn

2015-12-20

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-12）

王琴飞（1982—），女，助理研究员，硕士，主要从事木薯功能物质分离与鉴定研究。E-mail：wangqf508@163.com

张振文（1975—），男，副研究员，博士，主要从事木薯采后处理与加工研究。E-mail：scuta96@163.com