固相萃取-高效液相法测定芝麻油中苯并（a）芘

蒋珍菊，王雁，杨巧

（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

固相萃取-高效液相法测定芝麻油中苯并（a）芘

蒋珍菊，王雁，杨巧

（西华大学食品与生物工程学院，四川成都610039）

建立一种快速、高效测定芝麻油中苯并（a）芘的固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）方法。样品前处理采用硅胶固相萃取柱串联氧化铝固相萃取小柱，稀释液和淋洗液选择正己烷，洗脱液选择二氯甲烷，在40℃下氮吹干后，乙腈复溶后检测。采用Waters RP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，以乙腈-水（90∶10）作为流动相，用荧光检测器检测，外标法峰面积定量。结果表明，苯并（a）芘在1.00 ng/mL～20.00 ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.999 8，检出限为0.05 μg/kg，定量限为0.16 μg/kg，加标回收率达到92.2%～98.5%。

高效液相；芝麻油；苯并（a）芘

苯并（a）芘（BaP）是一种多环芳烃，分子结构式如图1所示，化学性能稳定，在烹调过程中不易被破坏，是多环芳烃类化合物中致癌性最强的一种物质，可以通过食物和饮水进入人体，人群流行病研究表明，食品中苯并芘含量与多种肿瘤的发生有关系，如乳腺癌、肺癌等［1-2］。植物油中含苯并（a）芘的主要原因包括：油料在晒干、烟熏、炒制过程中可产生苯并（a）芘；用溶剂浸出法制油时，所用溶剂中含有多环芳烃；油受热温度过高和时间较长时可生成苯并（a）芘。在标准GB 2762-2012《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定了油脂及其制品苯并（a）芘限量值为10 μg/kg［3］。

图1　苯并（a）芘结构图Fig.1Structure of benzo（a）pyrene

现有检测苯并（a）芘的方法有荧光分光光度法［4］、气相色谱法［5］、高效液相色谱［6］等，其中高效液相色谱-荧光法为常用检测方法。参考标准GB/T 22509-2008《动植物油脂苯并（a）芘的测定：反相高效液相色谱法》中检测动植物油脂中苯并（a）芘的方法［7］，需要先自行处理中性氧化铝至Ⅳ级活度，再填装层析柱，对操作者的实验技能要求较高、溶剂消耗量大、步骤复杂，难以保证结果的准确性和重现性，使得苯并（a）芘的检测工作实验室推广存在一定难度。本试验在前处理过程中改用商业化苯并（a）芘专用固相萃取柱，优化了前处理的条件，使整个前处理过程简单化，这样使得并（a）芘的检测既能保证准确性和重复性，又能满足简单快捷的要求。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

2695高效液相色谱系统、2475荧光检测器：Waters；RV10旋转蒸发仪：IKA。

甲醇中苯并（a）芘溶液标准物质（4.95 μg/mL）：购于中国计量科学研究院；甲醇、乙腈为色谱纯。

Cleanert BAP-3氧化铝固相萃取小柱（活度为Ⅳ级）、Cleanert Si硅胶固相萃取柱：博纳艾杰尔，3cc。

1.2样品来源

样品均为随机抽取市场上销售的芝麻油。

1.3色谱条件

色谱柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

柱温：30℃；流动相：乙腈+水。

荧光检测器：发射波长：406nm，激发波长：384 nm。

1.4方法

1.4.1流动相体系中乙腈-水比例对苯并（a）芘色谱行为的影响

固定流动相洗脱速度，流动相选择不同的乙腈-水体积比例，流动相组成Ⅰ：乙腈-水（84∶16）；流动相组成Ⅱ：乙腈-水（88∶12）；流动相组成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流动相组成Ⅳ：乙腈-水（92∶8）；考察对苯并（a）芘分析效果和出峰时间的影响，确定最佳流动相比例。

1.4.2标准曲线的制作

吸取适量的苯并（a）芘标准品，配制成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL标准溶液，进液相色谱仪进行分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.3样品前处理条件的优化

在按标准方法［7］处理时，选用的是氧化铝柱作为苯并（a）芘的吸附载体，但是在实际试验中效果并不理想，杂质干扰峰较多，加标回收率不高，所以本试验选用Cleanert BAP-3小柱，对样品进行固相萃取的优化。针对芝麻油，还会在Cleanert BAP-3小柱前串联Cleanert Si硅胶固相萃取柱，来比较优化前后的效果。结果都以样品加标平均回收率为比较依据，来制定较优的前处理条件。

1.4.4加标回收试验

以未检出苯并（a）芘的芝麻油为空白基质，分别加入标准溶液40.0 ng，选择优化后的前处理条件操作，氮吹近干后再用流动相定容至2.0 mL，过0.22 μm滤膜后上机检测，计算回收率。

2　结果与分析

2.1乙腈-水溶液体系对苯并（a）芘色谱行为的影响

为了了解乙腈-水溶液对苯并（a）芘色谱行为的影响，本研究固定流动相洗脱速度，改变乙腈-水的比例，流动相组成Ⅰ：乙腈-水（84∶16）；流动相组成Ⅱ：乙腈-水（88∶12）；流动相组成Ⅲ：乙腈-水（90∶10）；流动相组成Ⅳ：乙腈-水（92∶8），考察对苯并（a）芘色谱行为的影响。结果表明：在乙腈-水溶液体系中，乙腈-水比例的不同对苯并（a）芘的色谱保留行为有不同程度的影响，其乙腈比例与苯并（a）芘保留因子的相互关系符合lnk=a+cCB方程［8-10］（其中k是保留因子，CB是流动相中强溶剂的浓度），且具有良好的线性（r2＞0.99）。当比例在乙腈-水（90∶10）时，苯并（a）芘在RP C18柱上可得到良好的基线分离，其峰型良好，如图2所示。

2.2标准曲线、检出限和定量限

为了验证苯并（a）芘在乙腈-水（90∶10）溶液流动相体系中的线性关系，配制了浓度为1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL的系列标准溶液。每个浓度重复测定5次，试验结果表明，苯并（a）芘在1.00 ng/mL～20.00 ng/mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.99）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的性噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到目标组分的LOD和LOQ分别为0.05 μg/kg和0.16 μg/kg，结果见表1。

2.3串联硅胶固相萃取柱的选择

考虑到芝麻油样品含油量比较高，直接用氧化铝固相萃取小柱处理后的样液较混浊，容易形成悬浮液。所以本试验选择在氧化铝固相萃取小柱前面串联硅胶固相萃取柱去油（图3中的B图），与没有串联硅胶固相萃取柱（图3中的A图）进行比较，结果以苯并（a）芘的回收率为比较依据。

图2　苯并（a）芘标准物质色谱图Fig.2Standard substance chromatogram of benzo（a）pyrene

表1　苯并（a）芘的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of benzo（a）pyrene

结果显示：在样品串联硅胶固相萃取柱后，处理后的样液澄清，不易形成悬浮液，样液上机后的色谱图中杂质干扰峰减少，样品的加标回收率高于未串联硅胶固相萃取柱，所以以下试验都选择氧化铝固相萃取小柱前面串联硅胶固相萃取柱，结果如图3所示。

2.4固相萃取稀释液、淋洗液、洗脱液以及加标方式的条件优化

参考相关标准和产品资料，在固相萃取步骤，对芝麻油样品的稀释液分别选择正己烷、石油醚和乙醚3种溶剂进行比较；淋洗液也相应的选择正己烷、石油醚和乙醚3种溶剂；洗脱液分别选择正己烷、二氯甲烷、石油醚和乙醚4种溶剂，结果以苯并（a）芘的回收率为比较依据。

图3　串联硅胶柱选择对苯并（a）芘色谱图的影响Fig.3The effect of selecting silica gel column on the benzo（a）pyrene chromatogram

对于加标回收试验，由于标准品是溶于甲醇里的，考虑到与样品互溶性的问题，比较两种加标方式Ⅰ：将标准品直接加入到样品里，Ⅱ：将标准品加入容器氮吹干后，样品加入容器里。

结果显示：在固相萃取步骤，样品的稀释液和淋洗液选择正己烷结果要略好于石油醚和乙醚，洗脱液选择二氯甲烷结果要优于其它3种溶剂；对于加标回收试验，加标方式Ⅱ明显优于加标方式Ⅰ，结果如图4所示。

图4　稀释液、淋洗液、洗脱液、串联硅胶柱以及加标方式的选择对苯并（a）芘平均回收率的影响Fig.4The effect of dilution solution，leaching solution，elution solution，tandem silica gel column and addition standard method on the average recovery rate of benzo（a）pyrene

2.5样品的测定及加标回收

在我们随机抽取的20个批次的芝麻油成品中，根据上述实验结果选用正己烷稀释样品，正己烷淋洗，二氯甲烷洗脱后，洗脱液在40℃下氮吹干后，2 mL乙腈定容后，上机检测。结果表明：用硅胶固相萃取柱串联固相萃取柱后，杂质峰对目标峰的干扰明显少于净化前。在所检测的芝麻油样品中，苯并（a）芘超标的有1个样品，加标回收率92.2%～98.5%，符合检测要求。

3　结论

本文建立了一种固相萃取-反相高效液相色谱法检测芝麻油中苯并（a）芘的分析方法，结果表明：在乙腈-水（90∶10）体系中，乙腈比例对于溶质的色谱保留行为具有较强的调节能力，苯并（a）芘得到了良好的基线分离；固相萃取阶段，样品上住后稀释液和淋洗液选择正己烷，洗脱液选择二氯甲烷，效果较好；加标实验中，先将标准品加入容器氮吹干后，样品再加入容器里后，对试验干扰更小；在氧化铝固相萃取柱前面串联硅胶固相萃取柱可有效去除芝麻油中的复杂基质对目标峰的影响。本试验加标回收率为92.2%～98.5%，最低检出量为0.05 μg/kg，满足国标中对植物油中苯并芘的检测要求。该法样品预处理简单，试剂消耗少、分析时间短，明显提高了检测效率，且其准确性和精密度好，可实现对苯并（a）芘的净化与富集，是测定芝麻油中苯并（a）芘含量的理想方法。

［1］李永红，金银龙．苯并（a）芘致癌机制研究新进展［J］．医学研究杂志，2011，40（8）：152-154

［2］叶萌，刘秉慈，杜宏举，等.苯并芘诱导人胚肺成纤维细胞cyclin D1，CDK4和E2F-1/4的表达改变［J］.卫生研究，2006（2）：135-138

［3］中华人民共和国卫生部.GB 2762-2012食品安全国家标准食品中污染物限量［S］.北京：中国标准出版社，2012

［4］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.27-2003食品中苯并（a）芘的测定［S］.北京：中国标准出版社，2003

［5］张莉，张永涛.固相萃取-气相色谱-质谱联用快速检测地下水中13种有机氯农药及苯并［a］芘［J］.分析实验室，2008，27（S）：400-402

［6］刘玉兰，张小涛，赵欢欢.液相色谱-串联质谱法检测食用油脂中苯并芘［J］.农业机械，2010（10）：45-48

［7］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 22509-2008动植物油脂苯并（a）芘的测定：反相高效液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2008

［8］JW Dolan，JR Gant，LR Synder.Gardient elution in high performance liquid chromatography：II.partical application to reversed phase systems［J］.J Chromatogr，1979，165（1）：31-58

［9］邹汉法，张玉奎，卢佩章.反相离子对色谱法及其应用［J］.色谱，1992，10（6）：329-333

［10］PC Lu，XM Lu.Development of a high performance liquid chromatography with artifical intelligence［J］.J Chromatogr，1984，292（1）：169-188

Determination of Benzo（a）Pyrene in Sesame Oil by Solid-phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

JIANG Zhen-ju，WANG Yan，YANG Qiao
（School of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of benzo（a）pyrene in sesame oil by solid－phase extraction coupled with high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.The samples were treated by silica gel SPE tandem alumina solid-phase extraction column，and the leaching solution of nhexane，the eluent of dichloromethane.The elution liquid was dried at 40℃under nitrogen，and detected after re-dissolution with acetonitrile.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile-water（90∶10）as mobile phase，with fluorescence detector and external standard method peak area quantification.The linear range of benzo（a）pyrene was in the range of 1.00 ng/mL-20.00 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 8.The detection limit was 0.05 μg/kg and the quantitative limit was 0.16 μg/kg.The recovery rate was 92.2%-98.5%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sesame oil；benzo（a）pyrene

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.026

2016-06-03

教育部春晖计划（Z2015116）；四川省三创项目资助（201510623086）

蒋珍菊（1974—），女（汉），教授，博士，研究方向：应用化学、食品质量与安全。