陕西产葛根药材的HPLC指纹图谱研究

北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂（100079）王海 姚璐 魏弘宜 迟玉明

葛根为豆科植物野葛P u e r a r i a lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，习称野葛，在中国大部分地区均有分布[1]。葛根主要有效成分为黄酮类物质[2]，主要有大豆苷元（daidzein）、大豆苷（daidzin）、葛根素（puerarin）、大豆苷元4’,7-二葡萄糖苷、7-木糖苷葛根素（7-xyloside puerarin）等[3]。中医认为葛根味甘辛，性平，具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒等作用[4]。现代药理研究表明，葛根能改善实验性心肌梗塞犬的心肌代谢，能改善高血压病人的项强、头晕、头痛、耳鸣等症状[5]。临床用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，眩晕头痛，中风偏瘫，胸壁心痛等症[6]。

中国药材公司曾进行全国中药资源普查，结果表明我国葛根资源分布广泛[7]，其中川产葛根[8]、贵州产葛根[4]、云南产葛根[9]的HPLC指纹图谱研究均有报道，陕西省是葛根药材的重要产地之一，然而陕西产葛根的质量研究较少见于报道[10][11]。本实验选用陕西省产葛根药材，建立原药材的高效液相指纹图谱，以对葛根原药材及制剂进行质量控制。

1 实验部分

仪器与试药：Waters 2695-2996高效液相色谱仪，Em-power色谱工作站，2996二极管阵列检测器。葛根干燥浸提物HRS（Code：Y0001200；Id：0038E9）由European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare提供。葛根对照品购于中国食品药品检定研究院（批号：110752-200912）。16批葛根样品由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂提供，均采自陕西安康葛根基地。乙腈为色谱纯，由Burdick & Jackson提供，其余为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密称取葛根药材粉末0.1g，置锥形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，用微孔滤膜（孔径为0.45μm）滤过，滤液作为供试品。

2.2 对照品溶液的制备 称取相当于3.0mg葛根素的葛根干燥浸提物HRS于250mL锥形瓶中，加入30%乙醇50.0mL，称重。加热回流30min，温度降至室温后再次称重，用30%乙醇补足失重，混合摇匀，过滤。

2.3 色谱条件 ①色谱柱：phenomenex Onyx Monolithic C18 100×4.6mm。②色谱条件：2根同系列色谱柱，长度0.10m，直径4.6mm，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；流速3.0mL/min；检测波长260nm；柱温30℃；梯度洗脱（见附表1）。

2.4 方法学考察

2.4.1 测定>方法 分别精密吸取葛根干燥浸提物HRS 10μL和供试品溶液3μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

2.4.2 峰识别 用葛根干燥浸提物HRS提供的色谱图和对照药材色谱库获得的色谱图来归属异黄酮类成分的7个共有峰。（3’-羟基葛根素，葛根素，3’-甲氧基葛根素，6-O＂-D-木糖-葛根素，大豆苷等）。葛根素保留时间约为7.0min，其他特征峰的保留时间、峰面积与葛根素峰比较的相对保留时间和相对峰面积（见附表2）。

2.4.3 精密度试验 取同一批次供试品，按照2.3色谱条件及2.4.1测定方法检测指纹图谱，连续进样6次，在同一台仪器上测定指纹图谱（见附表3），结果表明，各色谱峰的相对保留时间基本一致，其中各共有峰相对保留时间RSD值均小于1.0%，峰面积RSD值小于4.42%，表明该方法进样精密度好。

2.4.4 稳定性试验 取同一批次供试品溶液，分别于制样后0h，2h，16h后按照2.3色谱条件及2.4.1测定方法检测指纹图谱（见附表4），结果表明，各共有峰的保留时间RSD小于1.01%，除7号峰外，其余共有峰峰面积RSD均小于2.0%。因此，认为供试品溶液至少在16h内稳定。

2.4.5 重复性实验 取同一批次葛根药材，平行制样6份，按照2.3色谱条件及2.4.1测定方法检测指纹图谱（见附表5），结果表明，各共有峰相对保留时间的RSD值均小于1.02%，峰面积RSD值均小于4.07%，表明该方法具有较好的重复性。

2.5 指纹图谱及技术参数

2.5.1 指纹图谱及共有峰的标定 按照对照品及供试品溶液的制备及检测方法制备样品溶液，分析比对葛根干燥浸提物HRS提供的色谱图及16批次陕西产葛根药材供试品的HPLC检测结果，总结共有7个共有峰（见附图1）包括：3’-羟基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、6-O＂-D-木糖-葛根素、大豆苷等。其中，葛根素保留时间约为7.0min，其他特征峰的保留时间、峰面积与葛根素峰比较的相对保留时间及相对峰面积（见附表3），通过计算中药材供试品的图谱及指纹图谱比较，非公有峰面积为总峰面积的8.2%。

2.5.2 不同批次陕西产葛根药材指纹图谱的相似度评价 以16批次不同陕西产葛根药材的HPLC指纹图谱（见附图2）进行数据分析，并建立共有模式，取共有模式作为这批样品的对照谱，采用《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，进行相似性分析，相似度均不低于0.9（见附表6）。

附表1 流动相梯度洗脱程序

附表2 指纹图谱分析结果

附表3 精密度试验结果

附表4 稳定性试验结果

附表5重复性试验结果

附表6 16批葛根药材相似度计算结果

附图1 葛根干燥浸提物图谱。峰2：3’-羟基葛根素；峰3：葛根素；峰4：3’-甲氧基葛根素；峰5：6-O＂-D-木糖-葛根素；峰6：大豆苷

附图2 16批葛根药材指纹图谱相似度评价结果图

3 讨论

利用中药材指纹图谱进行定性或定量分析是当前中药质量评价的主流，通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保质量的相对稳定。陕西省是葛根药材的重要产地之一，而关于陕西产葛根药材的指纹图谱研究鲜见于报道，故本次试验重点研究了陕西产葛根药材指纹图谱的建立。

在选择供试品溶液的制备方法时，本次试验对提取溶剂、提取方法及提取溶剂浓度进行了考察，以葛根素含量及总异黄酮含量为考察指标进行评价。提取溶剂的考察涉及30%甲醇及30%乙醇，对比考察结果，认为乙醇作为提取溶剂效果较好。提取方法的考察中对比了超声及回流的方法，实验结果表明回流方法较好。最后对比了20%乙醇、30%乙醇、60%乙醇、80%乙醇的提取结果，认为30%乙醇作为提取溶剂，葛根素及总异黄酮含量较高。最终确定以30%乙醇加热回流30分钟作为提取方法。

葛根的主要化学成分为异黄酮类成分为黄酮类化合物、三萜类、香豆素类等，其中黄酮类化合物的含量达12% 。葛根主要有效成分为葛根素，葛根素为异黄酮类化合物，其色谱峰无明显干扰，故本次实验选葛根素为参照峰，即S峰，以S峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值[12][13]。

通过分析本次试验的精密度实验结果、稳定性实验结果、重复性实验结果，以及植物图谱的相似度，认为该16批样品具有较好的相似性，因此认为此次建立的葛根药材指纹图谱适用于陕西产地的葛根药材。