水氮添加对古尔班通古特沙漠土壤细菌多样性的影响

苏延桂

(中国科学院干旱区生物地理与生物资源重点实验室，中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆 乌鲁木齐 830011)



水氮添加对古尔班通古特沙漠土壤细菌多样性的影响

苏延桂

(中国科学院干旱区生物地理与生物资源重点实验室，中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆 乌鲁木齐 830011)

本研究以我国古尔班通古特沙漠东南缘原生梭梭生长区为研究区，通过模拟30%的年降雨量增加和5 gN m-2·yr-1的氮沉降，研究土壤微生物生物量和土壤细菌群落多样性和结构对模拟降水增加和氮沉降的响应.研究结果表明，模拟降雨增加显著提高了春季短生植物和春夏一年生植物生长旺季土壤微生物生物量碳和氮，模拟氮沉降对微生物生物量的影响非常微弱，与单独模拟降水增加相比较，降水和氮沉降同时增加对微生物生物量并没有显著影响.模拟降水增加和氮沉降对细菌多样性的影响因采样时段而异.模拟降水增加在春季短生植物和春夏一年生植物生长旺季对细菌多样性的影响强度高于冬季和早春融雪期，模拟氮沉降对细菌多样性的影响在冬季更为显著.微生物群落结构在不同采样时段表现出明显的不同，虽然模拟降水增加和氮沉降也影响微生物群落结构，但影响强度不如季节变化明显.

PCR-DGGE; 氮沉降; 降雨增加; 微生物群落结构; 温带荒漠

土壤细菌是土壤微生物的重要组成部分，它们在土壤发生和发育过程中的重要作用不仅表现在对土壤微生物多样性的维持和贡献方面，更重要的是，细菌群落多样性的变化对土壤主要生态过程的影响非常深刻[1-2].如异养细菌对土壤有机质的分解过程和特征的改变影响着土壤有机碳的储量和稳定性特征[3]；一些具有异形胞细菌对土壤氮储量和累积的贡献[4-5].基于土壤细菌群落的重要生态功能，近年来对土壤细菌多样性和物种组成的研究已在各类生态系统开展了大量的研究工作，尤其是利用分子生物学的手段从微观尺度上揭示了不同生态系统群落结构特征[6-7].

现有的模型研究和实证调查均表明，我国北方生态系统正经历着降水增加[8]和氮沉降加剧[9]的双重环境影响，大量的野外模拟控制实验多集中于地上部分对气候变化的响应方式和强度[10-12].然而，土壤微生物作为对气候变化响应较为敏感的一个类群，却长期没有得到应有的重视，与地上植物群落的研究相比，对地下微生物的响应研究相对匮乏[13-15].

古尔班通古特沙漠是我国最大的固定、半固定沙漠，对该区域年降雨量的模拟研究发现，到2030年，该沙漠年降雨增加量将是本世纪初年降雨量的30%[8]；对氮沉降的多年观测研究也发现，由于近些年沙漠周边绿洲的开发，大气氮沉降量已达到3.6 gNm-2·yr-1[9].前期对古尔班通古特沙漠东南缘水氮添加引起的生态系统过程相关参数的调查研究表明，水分添加显著提高了春季短命植物和春夏一年生草本生物量，而氮素添加对草本的影响相当有限，并且，在降雨增加的情况下，氮素添加的正效应才能得到显现[16].同时对碳通量的观测表明，水分增加对生态系统净通量的影响依赖于年降雨量，在降雨量较高的年份，降雨的增加有利于生态系统碳储量的增加，而在干旱年份，水分的增加却刺激了生态系统的碳释放[17].由于植物生物量的改变必然会引起土壤地下碳输入量的改变，这可能会对细菌群落结构产生影响[18]；同时，考虑到细菌对水分变化的敏感性[3]，我们假设水分的增加可能会改变细菌群落结构.氮沉降使得土壤酸化已在很多生态系统中得到了证明[19]，而pH的改变被认为是影响土壤微生物群落结构最为关键的环境因素.我们假设，氮沉降对土壤微生物群落的影响可能会通过改变土壤pH而实现.

1　研究区概况

研究区位于古尔班通古特沙漠东南缘 (44°17′ N，87°56′ E，475 m a.s.l).该区气候属于大陆性干旱气候，冬季严寒，夏季干热，春秋温凉，年平均降水量约为160 mm，其中60%的降雨分布在4～9月，冬季降雨可到30 cm，是该区域春季短命植物和春夏一年生植物种子萌发的主要水分来源.年平均气温约为6.6 ℃，年平均蒸发潜力约为1 000 mm.沙丘表面植被覆盖度可达15%～50%, 主要灌木为白梭梭(Haloxylonpersicum)和梭梭(Haloxylonammodendron)，草本包括条叶庭荠(Alyssumlinifolium), 齿稃草(Schismusarabicus) , 飘带莴苣(Lactucaundulate), 尖喙牻牛儿苗(Erodiumoxyrrhynchum), 卷果涩荠(Malcolmiaafricana), 丝叶芥(Leptaleumfilifolium), 浆果猪毛菜(Salsolafoliosa)，粗枝猪毛菜(Salsolasubcrassa) , 角果藜(Ceratocarpusarenarius) 和珍珠猪毛菜(Salsolapasserina)等.沙漠中土壤以固定、半固定的风沙土占绝对优势, 固定风沙土主要分布于垄间低地及沙垄中下部, 半固定风沙土多分布于沙垄中部和中上部.

2　材料与方法

2.1实验处理和土样采集

长期样地建立于2010年，实验处理开始于2011年初.样地建设包括增加降水和增加N素两个处理，每个处理因素包括对照在内共三个水平，N素添加以硝酸铵为原料，三个水平为无添加，中水平N素添加(2.5 gNm-2·yr-1)和高水平N素添加(5 gNm-2·yr-1).于每年的4月中旬和7月中旬添加，以分别满足春季短生植物和春夏一年生草本植物的需要.降水添加通过设置降水转移装置，将样地外围的自然降水汇集，通过滴灌的方式均匀添加至样方内.降水添加的三个水平为：无添加、增加正常降水15%、增加正常降水30%.各因素水平按正交处理，形成9个处理水平.另外，在每一区组外，增加正常自然对照.总计包括10个处理水平.每个处理水平设置6个重复，共计60个试验小区.区长10 m，宽10 m，小区面积为100 m2.小区间距10 m，区组间距10 m，四周留歩道各1 m.每组试验区(不含保护行)长 120 m，宽30 m，占地0.36 hm2.小区布设按区组设置，选择地势平坦、一致的三个垄底，作为三个样地，每个样地中，按照地形因素，设置两个区组，每个区组中随机排列10个处理样方.在本研究中，我们选择对照，5 gNm-2·yr-1氮添加，30%降雨增加和5 gNm-2·yr-1氮添加与30%降雨同时添加四个处理.

根据研究区内明显的季节特征，我们分别采集了代表冬季土壤冻结时段(11中旬)，早春融雪期间(3月22日)，春季短命植物生长旺季(5月20日)和春夏一年生植物生长旺季(8月15日)的土壤.土壤采集利用土钻和环刀在梭梭灌木间采集0～5 cm土壤样品，每个样地采集3个重复，将三个样品均匀混合，置于灭菌袋中带回实验室.在采集过程中，对于不同的样地，土壤采集前先将酒精喷洒于采样器表面，点火高温处理后采集土壤.

在每次土壤采集中测定土壤含水量.在土壤冻结和早春融雪期，利用环刀采集0～5 cm土壤，带回实验室将土样置于105 ℃烘箱中72 h，测定土壤质量含水量，结合土壤容重，计算土壤体积含水量；在春季短生植物生长旺季和春夏一年生植物生长旺季，利用时域反射仪测定土壤体积含水量(HH2-Delta T Device moisture meter, UK).土壤速效氮用0.2 mol·L-1KCl提取，采用流动分析仪测定(AA3, BRAN-LUEBBE Ltd.,Hamburg,Germany).土壤可溶性有机碳采用0.5 mol·L-1K2SO4提取后用碳、氮分析仪测定(multi N/C 3100,Jena,Germany).

2.2PCR-DGGE

土壤细菌总DNA提取采用改良CTAB法.以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F(CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)扩增样品16S rDNA高变区序列.其中，50 μL PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC-338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH2O至50 μL.PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最终72℃延伸10 min.

DGGE电泳：PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收.PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统.取10 μL PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳(DGGE)分析.采用变性梯度为35%～55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100%尿素7 mol·L-1和40% (v/v)的丙烯酰胺)在1×TAE缓冲液中150 V 60 ℃下电泳5小时.变形梯度凝胶电泳(DGGE)完毕后、采用银染法染色.用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带.以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增.其中PCR扩增体系(50 μL)为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 1 μL；补ddH2O至50 μL.PCR扩增程序为在94℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后，72 ℃延伸10 min.将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定.

2.3数据处理

DGGE图谱分析:采用QuantityOne-1-D软件(Version 4.5)对DGGE条带进行数字化分析.DGGE条带中DNA含量与其灰度(范围0-255，0为最小值，255为最大值)呈线性关系，因此，条带灰度来代替每个DGGE条带的扩增量(Ni)用于计算.每个条带的相对含量fi为该条带的灰度值与该列所有条带灰度平均值的比值.根据fi值计算细菌群落结构多样性指数(H′)和均匀度指数(J).利用R(http://www.r-project.org)中vegan包进行排序分析.模拟降水增加和氮沉降对土壤可溶性有机碳，速效氮和体积含水量的影响利用重复测定的方差分析(Repeated measures ANOVA).

3　结果与分析

3.1环境条件的季节变化特征

土壤体积含水量，土壤速效氮和土壤可溶性有机碳在四个采样时间点差异显著(表1-4，P<0.05).土壤体积含水量在早春融雪阶段和冬季较高，而在植物生长旺季相对较低；土壤速效氮和土壤可溶性有机碳也表现出相似的变化规律.在春季短生植物生长旺季和春夏一年生植物生长旺季，模拟降雨增加显著提高了土壤含水量和土壤可溶性有机碳；而在冬季和早春融雪期，模拟降雨增加对土壤体积含水量的影响非常有限.模拟氮沉降显著提高了土壤速效氮，而对土壤体积含水量和可溶性有机碳含量的影响非常有限.

表1　模拟降水增加和氮沉降在冬季对土壤体积含水量、土壤速效氮和土壤可溶性碳

表2　模拟降水增加和氮沉降在早春融雪期对土壤体积含水量、土壤速效氮和土壤

表3　模拟降水增加和氮沉降在春季短生植物生长旺季对土壤体积含水量、土壤速效氮和

表4　模拟降水增加和氮沉降在春夏一年生植物生长旺季对土壤体积含水量、土壤速效氮和

3.2模拟降水增加和氮沉降对土壤微生物生物量碳、氮的影响

模拟降水增加显著提高了春季短生植物生长旺季和一年生植物生长旺季土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮(图1,P<0.05).氮添加对土壤微生物生物量碳和氮的影响非常小，在两个观测季节，氮添加微弱地提高了微生物生物量氮含量(图1,P>0.05).与对照相比，模拟降雨增加和氮沉降对微生物生物量碳和微生物生物量氮均有显著刺激作用(图1,P<0.05)，然而与单独模拟降雨增加的处理相比，并没有显著提高土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮(图1,P>0.05).

在两个观测季节，土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮在春夏一年生植物生长季显著高于春季短生植物生长季(图1).土壤微生物生物量碳在对照区分别为0.23 gC·kg-1和0.46 gC·kg-1，微生物生物量氮分别为0.02 gN·kg-1和0.04 gN·kg-1.

图1　模拟降雨增加和氮沉降对微生物生物量碳和氮的影响(不同小写字母表示处理之间差异显著)

3.3模拟降水增加和氮沉降对土壤细菌多样性的影响

模拟降水增加普遍增加了土壤细菌香农-威尔多样性指数和丰富度，相应的，降低了土壤细菌均匀度指数(图2).模拟降水增加对细菌多样性和丰富度的最强影响作用出现在春季短生植物生长季，分别提高了15.2%和56.5%，最低出现在冬季和早春融雪阶段(图2).与模拟降水不同，模拟氮沉降对土壤细菌多样性和丰富度的影响程度在四个采样时间点表现不同.模拟氮沉降对冬季细菌多样性和丰富度的分别提高了7.3%和26.7%，而在春季短生植物生长旺季的影响作用最低，分别提高了2.4%和8.6% (图2).模拟降水和氮沉降同时增加对土壤细菌多样性和丰富度的最大影响出现在春季短生植物和春夏一年生植物生长旺季，对细菌多样性和丰富度的提高分别为7.8%～9.8%和23.3%～34.8%(图2).

在四个观测时段，细菌多样性和丰富度指数表现出明显的季节变化(图2).细菌香农-威尔多样性指数在冬季最高(3.33)，而在春季短生植物生长季最低(2.98).相似的，细菌丰富度指数在冬季和春夏一年生植物生长旺季最高(30)，在春季短生植物生长旺季和早春融雪期最低(23).

PCA排序表明(图3)，细菌群落组成在不同观测时段差异明显，其中，冬季细菌群落组成明显不同与其它三个观测时段.除春季短生植物生长旺季外，模拟降雨增加和氮沉降对细菌群落结构的改变非常有限.在早春短生植物生长旺季，模拟降水增加和氮沉降以及二者同时增加均明显改变了土壤细菌群落结构.在检测到的53种细菌中，其中22种属于变形菌门，9种属于放线菌门，7种属于蓝藻门，7种属于酸杆菌门，4种属于拟杆菌门.

4　结论与讨论

干旱荒漠区土壤微生物生态功能的执行在很大程度上取决于水分和呼吸底物的有效性[20-21].本研究发现，模拟降水增加和氮沉降对土壤微生物生物量的影响不同.模拟降雨增加显著提高了微生物生物量碳和氮，而模拟氮沉降对微生物生物量碳和微生物生物量氮的影响很有限，这说明，在干旱荒漠区，微生物的生长首先受限于水分.同时，研究结果表明，与单独模拟降水增加相比较，模拟降水和氮沉降并没有产生叠加效应，这说明，在降水增加的背景下，氮素可能不会对微生物生长产生抑制作用.

图2　模拟降水增加和氮沉降在不同采样时间点对土壤细菌香农-威尔多样性指数、丰富度指数和均匀度指数的影响

干旱、半干旱区水分增加对土壤微生物生物量的正效应在以往的很多研究中得到了证实[22-23]，其中，较多的研究通过模拟土壤干、湿交替，观测微生物生物量的变化以阐述土壤水分的效应[24-26]，也有部分研究通过在室内控制土壤含水量，测定土壤微生物生物量的变化以阐明水分的效应[27].然而，很少有研究通过长期的野外控制实验，阐明水分对土壤微生物生物量变化的作用[22].事实上，土壤水分的变化会引起其它土壤环境条件的改变，其中土壤可溶性氮和土壤温度与水分的协同变化可能也对土壤微生物生物量的变化产生影响[28-29]，而这一点在室内模拟实验中并不能得到很好的检验.同时，虽然野外的干、湿交替能在一定程度上反映水分改变所引起的土壤其他环境条件的变化，但是考虑到微生物相对较短的生活史和快速的适应特征，持续几天到几个月的野外模拟实验可能并不能完全的反映微生物的这些变化.因此，长期的观测实验更能够真实的反映干旱荒漠区微生物对降水增加的响应特征.

模拟降水增加对细菌群落多样性和结构的影响在四个观测时段表现不同.水分增加对细菌多样性的影响在春季短生植物和春夏一年生植物生长旺季更加明显，而在冬季和早春融雪阶段的作用很微弱.土壤含水量在春季短生植物生长旺季和春夏一年生植物生长旺季相对其余两个时段较低，同时，增加的降水显著提高了草本层植物生物量，使得土壤可溶性碳的含量显著增加.土壤水分和可溶性碳对干旱荒漠区土壤微生物多样性和生长的影响在很多研究中得到证实[20-21]，我们的研究进一步说明，模拟降水的增加一方面通过水分有效性的提高，另一方面通过提高微生物呼吸底物的含量而对土壤细菌多样性产生影响.而在冬季和早春融雪阶段，模拟降雨增加对土壤微生物群落结构的改变非常有限，一个可能的原因是由于土壤含水量本身相对较高，可达到8.9%，对于适应于干旱环境的荒漠土壤微生物，模拟降雨增加的土壤含水量(1.5%)对土壤细菌多样性的改变可能非常有限；另一个方面，由于冬季和早春融雪期较低的土壤温度限制了土壤微生物的生长，使得水分增加对土壤细菌多样性的影响程度很有限.

图3　模拟降水增加和氮沉降对土壤细菌群落组成的PCA排序分析

与模拟降水增加的效应不同，模拟氮沉降对土壤细菌多样性的影响在冬季和早春融雪阶段更加明显，而在春季短生植物和春夏一年生植物生长旺季的效应相对较弱.土壤速效氮增加对土壤微生物多样性的影响多集中于讨论氮添加对土壤pH的改变方面，在本研究区，模拟氮沉降对土壤pH的改变非常微小，并且现有的结论也表明，土壤微生物群落与pH并没有直接的相关性[16].此外，以往对土壤氮循环的相关研究表明，土壤微生物在冬季固持氮以维持其基本的生理活性[30-32]，在本研究中，氮素添加显著提高了冬季土壤速效氮含量，速效氮含量的提高可能有利于冬季土壤微生物多样性的提高，同时，对土壤细菌生物量氮的研究将有利于我们认识氮沉降对微生物动态的效应.

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责任编辑：郑敬刚

Effects of Water and Nitrogen Addition on Soil Bacteria Diversity in the Gurbantünggut Desert

SU Yan-gui

(KeyLaboratoryofBiogeographyandBioresourceinAridLand,XinjiangInstituteofEcologyandGeography,ChineseAcademyofSciences,Urumqi830011,China)

Selecting protogenesis sacsaoul growing region of the southeastern fringe of the Gurbantünggüt Desert as research area. Simulating a 30% increase in precipitationand 5 gN·m-2·yr-1nitrogen deposition ,the paper studies soil microbial biomass , bacterial community diversity and structure responses to the increase in annual precipitation and nitrogen deposition alone.The result shows simulating precipitation increased soil microbial biomass carbon and nitrogen at the growth peaks of spring ephemerals and spring-summer annuals, while nitrogen deposition at a rate of 5 gN·m-2·yr-1has a weak effect on soil microbial biomass; precipitation addition and nitrogen deposition in combination has similar effects on soil microbial biomass with precipitation addition alone. Precipitation addition and nitrogen deposition effects on bacterial diversity differing with regard to the different sampling time. Precipitation addition had significantly stronger influence at growth peaks of spring ephemerals and spring-summer annuals than that in winter and snowmelting, while nitrogen deposition had stronger effects on bacterial diversity in winter. Soil bacterial community shows large variations with sampling times, although precipitation addition and nitrogen addition also altered bacterial community composition, its effects are much weaker than the sampling duration in this study.

PCR-DGGE; nitrogen deposition; increasing precipitation; soil microbial community structure; temperate desert.

2016-03-25

国家自然科学基金(41371004)

苏延桂(1980—)， 女，甘肃兰州人，副研究员，博士，研究方向：干旱区土壤碳循环.

1671-9824(2016)05-0102-08

S154.1

A