芪红水煎液对免疫肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化标志物的影响*

杜宇琼 车念聪 张秋云 高连印 王金光 李文新

（首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京100069）

芪红水煎液对免疫肝纤维化大鼠肝功能及肝纤维化标志物的影响*

杜宇琼 车念聪 张秋云 高连印 王金光 李文新

（首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京100069）

目的观察芪红水煎液对猪血清诱导的免疫肝纤维化模型大鼠的肝功能及血清肝纤维化标志物的影响。方法模型制备采用腹腔注射无菌猪血清，每周2次，连续12周。成模后，用芪红水煎液干预治疗，秋水仙碱对照。实验结束血液生化检测肝功能，放射免疫法检测大鼠血清肝纤维化指标。结果与正常组大鼠比较，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP水平均显著升高（均P＜0.01），说明造模成功。秋水仙碱组ALT、AST、ALP水平与模型组大鼠相比较差别均不大（均P＞0.05）；而芪红水煎液组大鼠血清ALT、AST、ALP水平与模型组比较均改善（均P＜0.01）。与正常组大鼠比较，模型组大鼠HA、LN、PCⅢ、IV-C明显升高（均P＜0.01），说明造模成功。秋水仙碱组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ与模型组比较，均有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05），Ⅳ-C则差别不大（P＞0.05）。芪红水煎液组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ也有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05）。结论提示芪红水煎液可以减轻肝细胞损伤，改善肝功能，保护肝组织，并降低肝纤维化程度，对肝纤维化有一定的防治作用。

肝纤维化芪红水煎液药效学大鼠

【Abstract】Objective：To explore the influence of Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction on liver function and hepatic fibrosis index of ratswith immunological liver fibrosis.M ethods：A ratmodel of hepatic fibrosis was constructed by using abdominal injection with pig serum，and treated with Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction.Liver function wasmeasured with automatic bio-chemical analyzer，and serum hepatic fibrosis index in ratswas detected by radioimmunoassay.Results：ALT，AST，HA，LN，Ⅳ-C and PC-Ⅲincreased obviously in hepatic fibrosis rats（P＜0.05）.Serum liver fibrosis indexes in Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction decreased obviously（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction haS definite prevention to immune hepatic fibrosis，and can reduce fibrosis degree；meanwhile，it can effectively decrease liver cell injury and improve liver function.

【Key words】Hepatic fibrosis；Astragalus root combined with Polygonum Orientale L.decoction；pharmacodynamics；Rats

肝纤维化是由多种原因导致的肝内纤维结缔组织异常沉积后，出现的肝脏功能或结构改变的一种病理状态，急性肝损害治疗不及时往往后遗肝纤维化。芪红水煎液是在肝病“虚、瘀”并存的病机［1］及钱英教授治疗肝病必“体用同调”的理论指导下［2］，采用计算机系统辅助分析，选用钱老抗肝纤维化方剂核心配伍水红花子、黄芪进行组方。前期动物实验发现水红花子及黄芪单独应用具有一定的抗肝纤维化作用，但通过其联合应用，能否达到减毒增效的作用有待进一步的研究。本研究以大鼠免疫肝纤维化模型为研究对象，给予芪红水煎液治疗，并与秋水仙碱治疗组进行比较，观察芪红水煎液的抗肝纤维化作用，为临床用药提供理论依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物清洁级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体质量180～220 g，鼠龄45 d，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001。饲养于首都医科大学实验动物室，恒温恒湿，自由进食进水，标准饲料喂养，温度（21±3）℃，湿度（50.2±2.0）%，12 h/12 h昼夜交替。

1.2药物与试剂猪血清：由北京平睿生物有限公司提供，生产批号20140713。秋水仙碱：购于首都医科大学附属北京友谊医院，生产批号400617，将秋水仙碱溶于蒸馏水配成1mg/100mL的溶液。水红花子、黄芪均由同仁堂药店提供，水煎制备成100%浓缩液，4℃保存备用。血清丙氨酸转氨酶（ALT）、谷氨酰转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒：由英科新创（厦门）科技有限公司提供。血清层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、透明质酸（HA）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）试剂盒：由北方生物研究所提供。

1.3主要仪器日本奥林巴斯株式会社全自动生化分析仪AU400、Biofuge 15r低温高速离心机（HERAEUS）、HTEMRO超低温冰箱（美国BEKCMAN公司）、XH6080放免仪。

1.4造模及分组正常组大鼠10只注射等量生理盐水，时间同造模组。造模组大鼠30只腹腔注射猪血清0.5mL，每周2次，共12周。造模结束后，随机抽取大鼠1只，处死并取肝组织进行病理观察，判定免疫肝纤维化模型是否成功［3］。

1.5分组及给药40只大鼠进行1周适应性喂养后随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组、芪红水煎液组。正常组予0.3 mL/100 g体质量生理盐水腹腔注射，每周2次，共12周；模型组不给予治疗药物，每日灌服蒸馏水1mL/100g，连续12周。治疗组于造模的第2天开始灌服药物，连续12周，其中秋水仙碱组，每日上午灌服秋水仙碱1次（0.1 mg/kg）；芪红水煎液组每日上午灌服水煎浓缩液1次（2.5 g/kg）。

1.6标本采集与检测大鼠0.5%氯胺酮腹腔注射麻醉后，心尖部纵向刺入心室腔采血，4℃静置30min后，4℃3000 r/min离心30min，分离血清，分装，-20℃保存。全自动生化仪检测ALT、AST、ALP。放免法检测血清纤维化4项指标HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ，按检测要求进行严格操作［4］。

1.7统计学处理应用SPSS16.0统计软件。计量资料以（表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠血清肝功能指标比较见表1。结果示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP水平均显著升高（均P＜0.01），说明造模成功。秋水仙碱组ALT、AST、ALP水平与模型组大鼠相比较差别均不大（均P＞0.05）；而芪红水煎液组大鼠血清ALT、AST、ALP水平与模型组比较均改善（均P＜0.01）。

表1　各组大鼠血清肝功能指标比较（U/L，

表1　各组大鼠血清肝功能指标比较（U/L，

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别n ALP ALT AST正常组8 69.30±27.24模型组8 91.20±27.00△△秋水仙碱组8 88.70±21.55 42.60±4.93 109.38±37.19 66.76±16.70△△145.00±35.73△△68.70±8.27 168.20±44.61芪红水煎液组8 61.10±15.07 43.50±8.21**99.61±22.32*

2.2各组大鼠血清肝纤维化指标比较见表2。结果示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C明显升高（均P＜0.01），说明造模成功。秋水仙碱组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ与模型组比较，均有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05），Ⅳ-C则差别不大（P＞0.05）。芪红水煎液治疗组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ也有不同程度降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表2　各组大鼠血清肝纤维化指标含量比较（

表2　各组大鼠血清肝纤维化指标含量比较（

组　别n HA（μg/L）LN（ng/mL）　Ⅳ-C（μg/L）PCⅢ（μg/L）正常组8模型组8秋水仙碱组8 97.59±4.25 120.31±8.64 98.35±16.74 113.11±11.36 119.87±19.22△△139.56±16.89△△132.27±25.60△△123.49±17.20△95.38±13.26**105.64±24.26**131.79±14.89 112.71±25.35*芪红水煎液组8 84.07±8.38**115.69±10.87**105.87±11.19**131.84±31.81*

3　讨　论

慢性肝病中肝细胞的炎症损伤是导致多种细胞、细胞因子参与肝纤维化的形成与发展的重要因素，所以有效保护肝细胞功能、抑制炎症细胞浸润，是目前已获公认的抗肝纤维化治疗的有效策略之一。血清HA、LN、Ⅳ-C及血清PCⅢ是肝内胶原组织的降解产物，能够反映肝纤维化的增生活动度、估计肝脏组织损害的程度［5］。近年来临床研究表明血清肝纤四项检查已被认为是理想的诊断慢性肝病患者病情发展状况和治疗效果，其变化是临床衡量炎症活动情况、纤维化水平、评价疗效及预后的重要参考依据［6］。HA是肝纤维化变化中最为敏感的指标之一，在肝纤维化早期其他指标尚未升高时就会升高，且其含量情况与肝纤维化水平呈正相关，对判断肝纤维化活动性及预后具有重要意义［7］。LN是反映肝损害严重程度及判断有无活动性肝纤维化的指标之一，主要与肝窦毛细血管化和汇管区纤维化情况相关，且在肝纤维化晚期的升高尤其明显［8］。Ⅳ-C是一类反映肝基底膜胶原变化的可靠指标，与门脉高压的程度密切相关［9-10］。PCⅢ血清含量可以反应Ⅲ型胶原的代谢情况［11］。秋水仙碱是目前公认的具有抗炎、抗肝纤维化［12］有效药物，临床试验表明该药可以增加肝硬化患者的生存率。

黄芪味甘，性微温，入脾肺二经，其富含黄芪皂苷，黄芪多糖，异黄酮类化合物及硒元素，含有21种氨基酸，参与机体的多种代谢，具有广泛药理作用。临床上用于增强机体免疫力、利尿、抗衰老、护肝、降压、抗病毒等［13］，黄芪在肝病早期可起到延缓肝功能损害及纤维化的作用［14］。实验研究报告［15］，黄芪可以减少总胶原及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原在大鼠肝脏中的病理性沉积，使胶原含量明显下降，对实验性肝纤维化具有明显的治疗作用。实验还进一步提示，黄芪抗肝脏纤维化的作用机制与其能够抑制星状细胞Ⅰ型胶原mRNA表达水平有关［16-17］，还有学者［18］认为，黄芪抑制肝组织ICAM-1的表达，从而抑制肝纤维化时的免疫反应可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。学者［19］应用黄芪注射液治疗慢性乙型肝炎，结果表明其具有明显抗纤维化作用，其抗肝纤维化作用可能与其调节免疫，改变细胞因子活性有关。水红花子，又名荭草实（《本草纲目》），咸、微寒，入肝、胃、脾经，可化痞散结，清热止痛，常用于痞块腹胀、肝脾肿大、颈淋巴结核、消渴、胃痛等病的治疗，临床配伍用水红花子消癥破积，健脾利湿主，治胁腹痞块、肿瘤、水鼓、食少腹胀、痰核瘰疬，取得了较好效果［20］。有研究表明，水红花子可有效降低肝纤维化血清学指标（HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ）水平，作用优于秋水仙碱［21］。

本研究以免疫肝纤维化大鼠模型作为研究对象，观察芪红水煎液对模型大鼠的抗肝纤维化作用，经过治疗后，发现芪红水煎液治疗组的免疫肝纤维化实验大鼠的血清ALT、AST、ALP含量等临床常用的反映肝细胞功能的重要血清生化指标的水平均有不同程度改善，证明芪红水煎液对免疫肝纤维化大鼠的肝细胞功能具有明确保护作用，且优于秋水仙碱组，说明芪红水煎液可以通过保护肝细胞、抑制炎症反应发挥其抗肝纤维化作用。芪红水煎液可降低模型组大鼠HA、LN、Ⅳ-C水平，且优于秋水仙碱，与相关报道结果类似［21］，证明芪红水煎液具有较好抗肝纤维化作用，并对肝内胶原的多个环节均有干预作用。

综上所述，芪红水煎液对肝纤维化有一定的防治作用，可减轻肝细胞损伤，改善肝功能，保护肝组织，并降低肝纤维化程度。但在肝纤维化复杂的病理过程，芪红水煎液的具体药理机制和作用靶点值得进一步实验研究与临床探索。

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Effect of Astragalus Root Combined w ith Polygonum Orientale L.Decoction on Liver Function and Hepatic Fibrosis Index of Rats w ith Immunological Liver Fibrosis

DU Yuqiong，CHE Niancong，ZHANG Qiuyun，et al.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research，Beijing 100069，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）09-1679-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.09.010

2016-06-07）

北京市教委科研计划项目（KM201610025012）