基于罗丹明B和金纳米粒子荧光共振能量转移检测卡托普利

田 锐， 薛李慧， 马 晨， 王靖原， 孙雪花， 栾建明， 李晓江

(1.延安大学化工学院，陕西延安 716000；2.延安市实验中学，陕西延安 716000)

卡托普利(Captopril)是第一代口服血管紧张素转换酶抑制剂，临床上广泛用于治疗各种高血压、冠心病等，然而当卡托普利用量过大时，会导致肾脏损害、循环系统衰竭等症状[1,2]，因此，建立准确、灵敏测定卡托普利含量的方法对指导临床用药有着重要的意义。目前，测定卡托普利的方法主要有高效液相色谱法[3 - 5]、化学发光法[6]、光度法[7]、原子吸收法[8]、流动注射分析法[9]和电泳法[10]等。但这些方法或需要昂贵的仪器、或操作繁琐，制约了它们的应用。

近年来，金纳米粒子(Gold Nanoparticles,AuNPs)因其制备简单、生物兼容性好、催化活性高，尤其是良好的光学性质而得到广泛应用[11]。基于分散态AuNPs对邻近荧光基团(如荧光染料)荧光猝灭的荧光分析法被广泛用于DNA、药物、金属离子等[12 - 14]的分析。本研究建立了一种基于罗丹明B(RhB)与AuNPs荧光共振能量转移测定卡托普利的荧光分析新方法，用于卡托普利药片中卡托普利含量的测定，取得了满意结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-7000型荧光分光光度计(日本，日立公司)；JEM-2100型透射电镜(日本，日立公司)；TU1901 紫外-可见分光光度计(普析光学仪器有限公司)；5804R型高速离心机(德国，艾本德股份公司)。

卡托普利标准溶液(4.6×10-3mol/L)：准确称取卡托普利标准品(含量99.5%，上海江莱生物科技有限公司)25 mg，用超纯水溶解后定容于25 mL的容量瓶中，使用时逐级稀释。罗丹明B标准储备溶液(1.0×10-4mol/L)：准确称取47.9 mg罗丹明B(分析纯，西安化学试剂厂)，用超纯水溶解后，定容于100 mL 容量瓶中。氯金酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；柠檬酸三钠(分析纯，西安化学试剂厂)。实验用水均为超纯水。

卡托普利药片(25 mg/tablet，上海普康药业有限公司，山西津华晖星制药有限公司)。

1.2 实验原理

以柠檬酸钠还原氯金酸得到的AuNPs被柠檬酸根保护，表面带负电荷，通过静电排斥作用使其保持稳定[16]。将AuNPs与RhB混合后，RhB分子可通过静电作用吸附在AuNPs表面，此时，由于AuNPs对RhB的荧光猝灭作用使体系呈现弱荧光；加入卡托普利后，卡托普利分子巯基上的S原子可与纳米金形成稳定的Au-S键而置换出RhB，使RhB远离AuNPs恢复其荧光，体系荧光增强。据此，通过测定加入不同浓度卡托普利后AuNPs-RhB体系荧光信号的变化，可以对卡托普利进行定量分析。卡托普利的荧光测定机理见图1。

图1 卡托普利的荧光测定机理Fig.1 Schematic diagram showing the mechanism for catopril detection

1.3 实验方法

1.3.1AuNPs的制备AuNPs按文献方法[15]进行制备。具体步骤为：将50 mL 1 mmol/L的氯金酸加入到100 mL圆底烧瓶中搅拌、加热，待溶液开始回流后快速向其中加入5 mL 38.8 mmol/L柠檬酸钠溶液，继续回流15 min后停止加热，待溶液冷却后用0.45 μm滤膜过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，于4 ℃ 保存。

1.3.2实验方法取2.0 mL AuNPs溶液于4 mL离心管中，加入1.0 mL 1.0×10-5mol/L RhB溶液，摇匀，静态吸附1 h后，于10 000 r/min高速离心10 min，用移液枪小心移去上清液，往沉淀中加入2 mL超纯水洗涤、离心、弃去上清液，然后加入2 mL超纯水重新分散后定量转移入10 mL棕色容量瓶，适当稀释后加入2 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，最后用超纯水定容，得AuNPs-RhB测定液。分别取900 μL测定液于一系列离心管中，然后依次往其中加入100 μL 超纯水、卡托普利标准品或样品溶液，放置反应1 h 后，在荧光分光光度计上测定背景(FB)和样品(FS)荧光信号，根据样品和背景的信号差△F(△F=FS-FB)测定卡托普利含量。

2 结果与讨论

2.1 AuNPs的表征及实验机理验证

图2 纳米金的吸收光谱图(内插图为TEM图)Fig.2 Absorption spectra of AuNPs(inset:TEM photogrph of AuNPs )

为了确定所制备AuNPs的尺寸和形貌，分别测了其透射电镜(TEM)和吸收光谱，结果如图2所示。图2显示合成的AuNPs在520 nm有强吸收，表明AuNPs直径为13 nm左右且无团聚[16]，由TEM结果可见AuNPs粒径均一分散性良好。

为了验证我们提出的实验机理，实验分别对AuNPs、AuNPs-RhB、AuNPs-RhB-卡托普利的吸收光谱及荧光光谱进行了扫描，结果如图3所示。由图3(A)可见，加入罗丹明B及卡托普利后纳米金的吸收光谱没有发生变化，表面罗丹明B和卡托普利的加入没有引起纳米金的团聚。图3(B)为RhB及加入卡托普利前后AuNPs-RhB体系的荧光光谱，图中曲线a、b、c的峰形及最大发射波长一致，表明AuNPs、卡托普利没有与RhB作用生成新物质。但比较曲线b、c可发现加入卡托普利后体系的荧光信号明显增强，这是由于加入卡托普利后，卡托普利可通过其分子中巯基S原子与AuNPs形成稳定的Au-S共价键而置换出RhB使其远离AuNPs，减小AuNPs对其荧光的猝灭作用，从而使体系荧光强度增强。以上结果都证明了我们提出的机理，即体系荧光信号的变化是由于AuNPs对RhB荧光的猝灭作用及卡托普利对RhB的置换作用。

图3 吸收光谱及荧光光谱Fig.3 Absorption and fluorescence spectra(A) Absorption spectrum(a.AuNPs;b.AuNPs-RhB;c.AuNPs-RhB-catopril;d.rhodamin B);(B) Flurescence spectrum(a.RhB;b.AuNPs-RhB-catopril;c.AuNPs-RhB).

2.2 分析条件的选择

图4 pH对测定体系荧光信号变化的影响Fig.4 Effect of pH on the change of fluorescence intensity

2.2.1溶液pH的选定溶液pH是影响分析检测的重要因素，它不仅影响AuNPs和卡托普利在溶液中的存在形式，也影响Au-S键形成后体系的稳定性。实验对4.0～10.0范围内不同pH值对测定的影响进行了考察，结果如图4所示。由图4可见，不同pH值加入卡托普利后体系荧光增加值△F不同，当体系pH为6.0时△F达到最大。这可能是由于：pH值过低时，一方面RhB质子化程度高使其与AuNPs的吸附作用增强，不利于RhB从AuNPs表面脱落；另一方面，卡托普利分子中的巯基也可能质子化使Au-S键不易形成，不能有效从AuNPs表面置换RhB。而当pH过高时，卡托普利分子中的羧基可能去质子化形成-COO-，-COO-与带负电荷的AuNPs之间的静电排斥作用增强，不利于卡托普利在AuNPs表面的吸附，RhB会自发从AuNPs表面脱落，背景信号增大。

此外，实验还考察了缓冲液组成及浓度对测定影响。分别将pH为6.0的等浓度的磷酸盐、Tris-HCl、乙酸-乙酸钠和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入到AuNPs-RhB体系中；测定加入卡托普利后体系的荧光变化。结果发现在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中体系最稳定且信噪比高；改变缓冲溶液浓度，发现柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为5 mmol/L时测定结果最佳，故实验选择加入pH=6.0的浓度为5 mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲来控制体系pH。

图5 不同卡托普利浓度下测定体系荧光光谱(内插图为标准曲线)Fig.5 Fluorescence spectra of AuNPs-RhB in different concentrations of catopril(inset:linearity curve) from bottom to top:0,9.2,23,46,92,125,148,184×10-8 mol/L of captopril.

2.2.2反应时间的选定取20.0 mL AuNPs-RhB溶液，加入500 μL 4.6×10-4mol/L的卡托普利标准溶液在室温下进行反应，每隔一定时间从反应体系中取出1.0 mL测定其荧光。结果表明，1 h内△F快速增大，此后△F增加缓慢，12 h后荧光信号不再增加。结合考虑测定灵敏度和实验效率选择反应时间为1 h。

2.2.3AuNPs和RhB浓度的选择AuNPs和RhB的浓度直接影响测定的灵敏度，由于游离RhB自身有很强的荧光，如果其浓度太高，会使背景信号增大；反之，若RhB浓度太低，则其在AuNPs表面吸附量不够，加入卡托普利后不能与其发生有效置换，使测定灵敏度降低。因此，只有在二者之间的平衡态时，测定才最灵敏，为此实验考察了AuNPs和RhB的浓度对测定结果的影响。实验中我们将一定量AuNPs与足够量的RhB混合作用后，通过离心洗涤除去过量的罗丹明B，然后将得到的AuNPs-RhB体系稀释一定倍数后进行测定，结果显示AuNPs与RhB(1.0×10-5mol/L)按体积比2∶1混合作用，稀释5倍后测定灵敏度最高。

2.3 标准曲线及检出限

优化实验条件下，对卡托普利进行测定，结果表明在9.2×10-8～1.8×10-6mol/L浓度范围内体系的△F与卡托普利的浓度呈良好的线性关系(图5)，线性方程为:△F=2.4728c-1.0515，相关系数r=0.9929，检出限为6.9×10-8mol/L。优化的实验条件下，对2.3×10-7mol/L卡托普利标准溶液平行测定，其相对标准偏差为1.32%(n=11)。

2.4 干扰的测定

在优化的实验条件下，考察了可能存在的添加剂对卡托普利测定的影响，结果表明：控制相对误差在±5%以内时，同浓度的葡萄糖、抗坏血酸、糊精、乳糖、蔗糖、淀粉，20倍的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+均无干扰。因此药物中常用的助剂、添加剂及一些常见金属离子对卡托普利的测定无影响。

2.5 样品测定

随机抽取10片卡托普利药片，研细混匀后准确称取适量(相当于卡托普利25 mg)，加入去离子水溶解后，转入25 mL容量瓶中定容、静置，依次用滤纸和0.45 μm滤膜过滤，按实验方法测定。测定结果表明该法测得的卡托普利含量与药品的标示量基本一致。为了进一步验证方法的准确性，采用标准加入法测定了样品的回收率，测得回收率在96.5%～106.5%之间，表明该法用于卡托普利片剂中卡托普利含量的测定结果准确。

表1 样品及回收率测定(n=3)

3 结论

在罗丹明B与纳米金粒子的混合体系中，金纳米粒子可通过静电作用与罗丹明B结合，使其荧光猝灭，加入卡托普利后，金纳米粒子与卡托普利形成稳定Au-S键而置换出罗丹明B，使罗丹明B远离金纳米粒子而恢复其荧光。据此建立了罗丹明B金纳米粒子荧光共振能量转移测定卡托普利的荧光分析新方法，该方法能够快速、灵敏的用于药物中卡托普利含量的检测。