超声提取-高效液相色谱法测定新疆昆仑雪菊中绿原酸的含量

王省超， 孙 颖, 王瑞英*, 王邦善

(1.新疆大学理化测试中心，新疆乌鲁木齐 830046；2.新疆产品质量监督检验研究院，新疆乌鲁木齐 830004；3.新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐 830046)

雪菊，学名为蛇目菊、双色金鸡菊，属菊科金鸡菊，具有清热解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效，对于治疗失眠、头痛、高血压、高血脂、心血管等疾病有很好的疗效[1 - 3]。绿原酸是植物在有氧呼吸过程中产生的一种苯丙素类化合物，具有多种生物活性，在清热解毒、抗菌消炎、抑菌和抗氧化等方面有良好功效[4,5]。研究发现，绿原酸是雪菊中有效成分之一，然而，新疆雪菊中绿原酸含量及其提取工艺的研究鲜有报道[6]。

本文以新疆昆仑雪菊为研究对象，采用超声法提取雪菊中的绿原酸，考察了甲醇浓度、超声功率、超声时间和料液比等单因素对新疆昆仑雪菊中绿原酸提取效果的影响，并设计L9(34)正交试验，优化出提取新疆昆仑雪菊中绿原酸的最佳工艺条件；同时，建立了高效液相色谱法(HPLC)测定绿原酸的含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱系统，附四元梯度泵，真空脱气机，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器及Agilent化学工作站。KQ-500超声波清洗器(500 W,40 kHz)，RT-205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，Millpore超纯水器(美国，Millpore公司)。

绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯，冰乙酸为分析纯，水为超纯水。

雪菊购于新疆乌鲁木齐市济康大药房。

1.2 实验方法

1.2.1样品的配制对照品溶液的配制：精密称量绿原酸对照品适量，用色谱纯甲醇溶解、定容至50 mL容量瓶中，配制成含绿原酸0.4320 mg/mL对照品储备液，置于4 ℃冰箱中保存备用。供试品溶液的制备：精密称取新疆昆仑雪菊粉末(过70目筛)1.0000 g，置于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL 60%甲醇溶液，超声提取60 min，定容至50 mL容量瓶中，取上清液离心10 min，再经0.22 μm滤膜过滤后，用于HPLC分析。

1.2.2HPLC条件色谱柱为Agilent TC-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.5%冰乙酸水溶液(40∶60，V/V)；流速为1.0 mL/min，检测波长326 nm，柱温为30 ℃；进样量为10 μL。对照品和供试品在该色谱条件的色谱图如图1所示。由图可知，绿原酸在该色谱条件下可实现良好分离。

2 结果与讨论

2.1 单因素适宜范围的确定

精确称取1.0000 g新疆昆仑雪菊粉末，超声处理，以甲醇溶液为提取溶剂，定容至50 mL容量瓶中，经0.22 μm滤膜过滤后，按“1.2.2”中色谱条件进样分析，考察各单因素的影响结果。综合考虑，选择正交实验各单因素水平如下：40%、60%和80%甲醇提取剂，40、60、80 min超声时间，300、400、500 W超声功率及1∶20、1∶25和1∶30料液比。

2.2 正交试验结果与分析

按上述单因素试验得出的试验条件，进行正交设计。选取甲醇浓度(A)、超声时间(B)、超声功率(C)和料液比(D)4个因素，每个因素3个水平，进行L9(34)正交试验，优化提取新疆昆仑雪菊中绿原酸工艺。由正交试验分析可知，4个因素对绿原酸的提取影响不完全相同，其影响因素大小为：超声时间>料液比>超声功率>溶剂浓度。由试验结果方差分析可知，B因素差异对绿原酸具有显著性意义(p<0.05)，A、C、D因素差异无显著性意义(p>0.05)。综合以上分析，超声提取法提取新疆雪菊中绿原酸最佳提取条件为：80%甲醇溶液，超声时间为60 min，超声功率为300 W，料液比为1∶25。

根据正交试验结果，按比例准确称取5份新疆昆仑雪菊，在最佳工艺条件下提取绿原酸，以“1.2.2”色谱条件测定其含量，绿原酸提取含量为9.9810 mg/g(RSD=1.15%，n=5)，与正交试验中最优水平比较相近，说明该工艺条件稳定、合理可行、可操作性强，达到工艺优化目的。

2.3 方法的标准曲线、精密度及重现性

按“1.2.2”色谱条件，分别将对照品溶液依次进样1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 μL，得出峰面积(Y)与绿原酸含量(X)的线性回归方程为：Y=451.021X-9.805，相关系数r=0.99998(n=7)。结果表明，绿原酸在0.01728～0.1210 μg间呈良好线性关系。

按照“1.2.1”方法制备对照品溶液，并连续进样5次，测定绿原酸峰面积并计算其RSD。对照品RSD为0.72%(n=5)，表明本方法精密度良好。精密称取5份1.0000 g新疆雪菊粉末，按“1.2.1”方法制备供试品溶液，并测定绿原酸峰面积，其RSD为0.41%(n=5)，表明本方法重现性良好。

2.4 回收率及稳定性实验

精密称取5份新疆昆仑雪菊粉末，分别加入一定体积、浓度为0.0864 μg/μL绿原酸对照品溶液，按“1.2.1”方法制备供试品溶液，并进样分析，计算回收率。结果表明绿原酸平均加标回收率为108.16%，RSD为1.10%(n=5)。

取同一供试品溶液，在24 h内，每隔2 h 按上述色谱条件进样分析，测定绿原酸峰面积，其RSD为1.13%，表明供试品溶液中绿原酸在24 h 内稳定。

3 结论

本文对新疆昆仑雪菊中绿原酸超声法提取工艺进行了优化，建立了简便、快速的高效液相色谱法同时测定了新疆昆仑雪菊中绿原酸含量。结果表明，经优化后的工艺能显著提高绿原酸提取量；绿原酸在0.01728～0.1210 μg(r=0.99998)范围内线性关系良好，平均加标回收率为108.16%，其RSD为1.10%(n=5)，适合新疆昆仑雪菊中绿原酸测定。