加压毛细管电色谱法同时测定饮料中柠檬黄和苯甲酸钠

赵彦勇，李利军，程 昊，黄文艺， 尤 磊，肖晓茹，刘伯洋

(1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室(广西科技大学)，广西柳州 545006；3.广西高校糖资源加工重点实验室(广西科技大学)，广西柳州 545006)

食品添加剂是现代食品工业的重要组成部分，目前我国允许使用的食品添加剂种类达到 2 500 余种。但是近些年来食品安全事件屡有发生，存在一些超范围、超限量使用食品添加剂甚至使用非法添加物的问题[1,2]。除了完善法律、加强监管外，食品添加剂分析检测方法的相关研究也成为热点[3]。

柠檬黄(Tartrazine)又称酒石黄，化学名称为1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠[4]，它是一种水溶性偶氮型色素，广泛用作食品药品的着色剂[5]，但是长期或者过量摄入对身体有害，甚至致癌[6]。苯甲酸钠(Sodium Benzoate)也称安息香酸钠，是常用的食品酸性防腐剂。然而长期或者过量摄入苯甲酸钠也会对人体产生危害并引起癌变[7 - 9]。因此，我国对柠檬黄和苯甲酸钠的使用都有严格的国家标准。

目前，柠檬黄和苯甲酸钠的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、分光光度法、毛细管电泳法[10,11]。加压毛细管电色谱(Pressurized Capillary Electrochromaography,pCEC)是一种新型分离分析技术，它是液相色谱与毛细管电泳的结合，兼具两者的优点，具有柱效高、选择性高、分离度大、快速检测等特点[12,13]。目前，pCEC逐渐广泛用于食品药品分离检测的研究[14]。本实验旨在建立利用pCEC同时分离检测饮料中柠檬黄和苯甲酸钠的新方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

TriSepTM-2100型加压毛细管电色谱(Unimicro Technologies)；UV-2102PC型紫外-可见分光光度计(UNICO)；AR124CN型电子天平(OHAUS)；SZ-93型自动双重水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；pHS-25型pH计(上海利达仪器厂)；GM-0.33型隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)；DL-60D型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；2009-1型台式电动离心机(常州国华电器有限公司)；0.22 μm孔径尼龙66针式过滤器(天津市津腾实验设备有限公司)。

柠檬黄、苯甲酸钠标准品(纯度≥98%，北京北化恒信生物技术有限公司)；乙酸铵(西陇化工股份有限公司)，NaH2PO4(广东台山市粤侨试剂塑料有限公司)，以上试剂均为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯(安徽时联特种溶剂股份有限公司)。实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 标准品与供试品溶液的制备

精密称取一定量的柠檬黄、苯甲酸钠标准品，分别用二次蒸馏水溶解定容至25 mL，分别配制得540、468 μg/mL的标准品储备液。避光4 ℃保存，备用。

准确移取市售饮料试样5 mL，超声处理30 min(功率：300 W，40 kHz)，除去碳酸饮料中的CO2。4 000 r/min 离心10 min。静置10 min，用津腾0.22 μm孔径针式过滤器过滤，作为供试品溶液。

1.3 电色谱条件

色谱柱：EP-100-20/45-3-C18毛细管填充柱(内径100 μm，总长度45 cm，有效长度20 cm，内径3 μm，ODS填料)。定量环体积为1 μL，首次进样量不小于40 μL，之后相同样品的重复进样量5 μL即可。流动相：20 mmol/L NaH2PO4-乙腈(60∶40，V/V)，泵流速为0.05 mL/min。分离电压为+2 kV，检测波长为245 nm，柱温定为25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 分离条件的优化

2.1.1有机流动相种类和比例的优化实验考察了乙腈和甲醇两种溶剂作为有机流动相对分离效果的影响。结果如图1所示，当乙腈作为有机流动相时，被测物质在6 min内实现分离。这是由于与甲醇相比，乙腈的粘度低，洗脱能力大，分析时间短，分析灵敏度高，故本实验采用乙腈作为有机流动相。此外还考察了乙腈体积分数为50%、40%和30%时的分离情况。实验结果显示，随着乙腈比例的降低，被测物质的保留时间延长，灵敏度降低，然而分离度增大。综合考虑，选择乙腈体积分数为40%作为分离条件。

2.1.2分离电压的选择电压是影响带电物质保留时间长短和灵敏度大小的重要因素，也是pCEC分离的主要动力之一，是形成电渗流的重要条件。实验考察了-2 kV、+1 kV、+2 kV和+4 kV电压下柠檬黄和苯甲酸钠的分离情况。当电压为-2 kV时，被测物质的峰形很差。从+1 kV到+4 kV，随着正电压不断增大，被测物质的保留时间不断减小，灵敏度不断增大，然而分离度不断减小，理论塔板数减小，柱效降低。综合以上因素，本文采用+2 kV作为分离电压。

2.1.3缓冲盐种类及浓度的选择流动相中的缓冲盐具有形成和稳定电渗流的作用，可以提高实验结果的稳定性和重现性，对分离效果也有一定影响。实验考察了NaH2PO4和NH4Ac对样品的分离效果的影响。如图2所示，当NaH2PO4作为缓冲盐时，苯甲酸钠的峰形很差。而NH4Ac作为缓冲盐时，柠檬黄和苯甲酸钠都有良好的峰形和分离效果。本实验采用NH4Ac作为缓冲盐。考察了10、20、30 mmol/L NH4Ac对分离效果的影响，实验结果表明，随着NH4Ac浓度的不断增大，被测物质的灵敏度有增大的趋势。这是由于缓冲盐的浓度越大，流动相的离子强度越大，离子化的被测物质转变为中性离子对复合物越多，相互之间的静电排斥效应越小，从而使得柱效增大。然而缓冲盐溶液的浓度越大，焦耳热也越大，容易造成盐析或者产生气泡。综合考虑，采用20 mmol/L的NH4Ac作为缓冲盐溶液。

2.1.4流动相流速的选择实验考察了流速为0.030、0.040和0.050 mL/min时柠檬黄和苯甲酸钠的分离情况。结果显示，流动相流速越大，物质的保留时间越短，而灵敏度减小，并且仪器损耗增大。综合考虑，流动相流速设为0.05 mL/min。

2.2 方法学的考察

2.2.1线性关系及其相关系数、检出限配制柠檬黄、苯甲酸钠的系列标准溶液。首先分别配制得到403.68 μg/mL柠檬黄、36.2 μg/mL苯甲酸钠的标准溶液，然后再分别稀释0.8、0.4、0.2、0.1倍，得到柠檬黄、苯甲酸钠的系列标准溶液。在优化条件下每个浓度平行测定3次。以平均峰面积y对样品浓度x(μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线。回归方程、线性范围、相关系数及检出限(S/N=3)见表1。

表1 柠檬黄、苯甲酸钠的线性关系及检出限

2.2.2重复性实验按照1.2节中样品供试品溶液的制备方法，分别制成不同饮料样品5份，进行平行试验测定。实验测得柠檬黄峰面积的相对标准偏差(RSD)为4.8%，苯甲酸钠峰面积的RSD为3.3%，重复性实验结果良好。

2.2.3样品测定和加标回收率实验取1.2节制备的供试品溶液3份，分别加入系列标准溶液进行加标回收，每份平行测定3次。回收率实验结果见表2。柠檬黄的回收率为103.4%～104.9%，苯甲酸钠的回收率为95.3%～97.2%，RSD均低于4.9%。

表2 柠檬黄和苯甲酸钠的加标回收率(n=3)

2.3 实际样品的检测

取1.2节制备的供试品溶液，利用加压毛细管电色谱法对供试样品进行分离检测，平行测定3次，实际样品的pCEC图谱如图3所示。饮料样品中柠檬黄和苯甲酸钠在8 min内实现了分离检测，测得其中柠檬黄的含量为80.80 μg/ mL，苯甲酸钠的含量为9.93 μg/ mL，符合食品添加剂国家标准[15]。

3 结论

本文建立了加压毛细管电色谱检测饮料样品中柠檬黄和苯甲酸钠的新方法。实验结果显示柠檬黄的回收率为103.4%～104.9%，苯甲酸钠的回收率为95.3%～97.2%，相对标准偏差(RSD)均低于4.9%。该方法简便可靠，有助于相关部门对市售饮料中柠檬黄和苯甲酸钠进行质量控制。