5-氨基酮戊酸光动力作用对白念珠菌超微结构的影响

张子平，钟　熙，程　波，苏惠春，陈丽红



5-氨基酮戊酸光动力作用对白念珠菌超微结构的影响

张子平，钟熙，程波，苏惠春，陈丽红

目的观察5-氨基酮戊酸光动力对白念珠菌细胞超微结构的影响，为研究5-氨基酮戊酸光动力抗菌的作用机制提供理论基础。方法设置实验组(5-氨基酮戊酸光动力作用后的白念珠菌组)及对照组，分别在透射电镜下观察2组菌株细胞的超微结构。结果透射电镜下，5-氨基酮戊酸光动力作用后的白念珠菌细胞肿胀变形，细胞壁、细胞膜结构不完整，细胞壁疏松，细胞膜与细胞壁之间间隙大小不一，部分细胞可见细胞壁棉絮状致密外层或细胞膜局灶性缺失的现象。结论5-氨基酮戊酸光动力对白念珠菌的细胞壁结构具有一定的影响。

氨基酮戊酸；光化学疗法；念珠菌，白色；显微镜检查，电子，透射

白念珠菌是人体皮肤和黏膜上定居的正常菌群之一。作为常见的条件致病菌，它可以共生的方式定植于人体皮肤黏膜、胃肠道和泌尿生殖道等重要部位，在环境的多因素调控下，白念珠菌可改变其形态，由酵母相转变成菌丝相。该特性在真菌的致病性上发挥着重要作用。目前，临床上常用的抗白念珠菌药物主要有4类：多烯类、唑类、丙烯胺类、棘白菌素类，但这些药物都存在一定的毒副作用，且临床上出现越来越多的耐药株[1]。因此，寻找新的高效、安全的抗真菌方法成为亟需解决的问题。5-氨基酮戊酸诱导的光动力在皮肤科主要用于肿瘤及多种良性增生性皮肤病的治疗，鉴于其高度选择性及较低的毒副作用，且随着真菌耐药菌株的不断出现，研究者逐渐把目光投向真菌感染性疾病。目前，国外已有研究证实，光动力疗法是一种通过使用光敏剂前体物质来杀死多种念珠菌的潜在方法。相对于哺乳动物来说，细胞壁是真菌细胞所特有的结构，是病原微生物抵御各种外界压力(渗透、氧化应激、紫外线等)的首个屏障[2]。它可激发和协调抵抗微生物的先天及后天性免疫应答。笔者通过对5-氨基酮戊酸介导的光动力作用后的真菌细胞壁超微结构的观察，研究光动力疗法是否会影响真菌的细胞壁结构，为新的抗真菌疗法提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料菌株：白念珠菌标准株(ATCC90028，由上海华山医院皮肤科惠赠)。试剂：5-氨基酮戊酸(上海复旦张江生物有限公司)，YPD琼脂培养基(2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%琼脂)，YPD液体培养基(2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物)，PBS液(实验室配制)，DMEM培养基(上海赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，3%戊二醛，1%锇酸等。仪器：透射电子显微镜(EM208，荷兰菲利浦公司)，倒置生物显微镜(BM-37BS，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司)，超薄切片机(Leica UC-6型，德国莱卡公司)。

1.2方法

1.2.1白念珠菌菌悬液配制取冷冻真空干燥保存的白念珠菌标准株ATCC90028转种于YPD琼脂培养基上，28 ℃恒温培养48 h。再从YPD琼脂培养基上挑取单个菌落接种于YPD液体培养基中，置28 ℃，200 r/min振荡培养16 h至对数生长期。1 500 r/min离心10 min，PBS洗涤2次。用含2.5%胎牛血清的DMEM重悬菌悬液。将菌液浓度调整为1.0×106～2.0×106cfu/mL。

1.2.25-氨基酮戊酸溶液配制将5-氨基酮戊酸用蒸馏水溶解并稀释成1 mol/L的原液，再将原液用含2.5%胎牛血清的DMEM稀释成100 mmol/L。

1.2.3白念珠菌菌悬液分组将1×106～2．0×106cfu/mL菌悬液接种于无菌96孔板中，分为实验组和对照组。实验组每孔100 μL 5-氨基酮戊酸溶液加100 μL菌悬液，对照组每孔加200 μL菌悬液，用锡纸包裹后，静态孵育30 min。孵育后实验组予光动力治疗仪红光照射(波长：635 nm，照光剂量为54.3 J，能量密度为96 mW/cm2，时间为3 min)，对照组不予红光照射。照光后，2组均于37 ℃振荡培养12 h，收集菌悬液。1 500 r/min，离心10 min，5 mL PBS洗涤2次。加入2 mL 10%胎牛血清离心，收集白念珠菌酵母细胞。

1.2.4透射电镜制样与观察步骤标本前固定：3%戊二醛-1．5%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS (pH 7.2) 4 ℃ 2 h以上；漂洗：0.1 mmol/L PBS (pH 7.2) 3次。标本后固定：1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾4 ℃ 1．5 h；漂洗：0.1 mmol/L PBS(pH 7.2)3次；脱水：50%酒精10 min→70%酒精饱和醋酸铀染液4 ℃过夜→90%酒精10 min→90%酒精-丙酮10 min→90%丙酮10 min→无水丙酮10 min 3次；浸透：无水丙酮+环氧树脂618包埋剂(1∶1)1.5 h,纯618包埋剂35 ℃ 3 h；包埋、聚合：35 ℃ 12 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 3 d；半薄切片，定位；切片、染色：超薄切片机切100 nm的超薄切片，经醋酸铀及柠檬酸铅分别染色5～15 min，蒸馏水水洗，透射电镜下观察并摄片。

2　结　果

对照组：白念珠菌标准株ATCC90028酵母细胞呈圆形或椭圆形。细胞壁、细胞膜结构连续完整，细胞壁全层厚约0.2～0.3 μm，位于细胞壁最外层的是纤维状、棉絮状的电子致密层结构，厚约0.05～0.1 μm，其下是较厚的电子透明层，厚约0.1～0.15 μm(图1)。实验组：白念珠菌标准株ATCC90028酵母细胞经5-氨基酮戊酸诱导的光动力处理后，细胞肿胀变形，细胞壁、细胞膜结构不完整，细胞壁破坏疏松，细胞膜与细胞壁之间间隙大小不一，其中位于细胞壁最外层的纤维状、棉絮状的电子致密层比未经光动力处理的菌株变薄，部分细胞可见细胞壁棉絮状致密外层或细胞膜局灶性缺失的现象(图1)。

3　讨　论

作为真菌和周围环境的分界面，真菌细胞壁在维持自身形态和活性、介导菌体粘附于宿主细胞以及保护菌体免受外界损伤等方面发挥着重要的作用。它可激发和协调抵抗微生物的先天及后天性免疫应答。参与构成白念珠菌细胞壁的主要成分有：葡聚糖、几丁质以及甘露聚糖。其中，细胞壁中所占比重最大的成分为葡聚糖，它由β-1，3葡聚糖及β-1，6葡聚糖等交联而成，约占细胞壁干质量的50%～60%[3]。几丁质是一种β-1,4 N-乙酰氨基葡糖聚合物，呈线状结构，虽然在细胞壁中的含量很少(仅占细胞壁干质量的1%～2%)，但其重要性却不容忽视，它与β-1，3葡聚糖一起构成了细胞壁刚性骨架结构，在维持细胞形态和抵御外界压力胁迫方面发挥了重要作用。2种聚合物共同协调和调控细胞在不同环境下的应答反应。药物和压力导致其中一种聚合物的数量改变后，可立即启动增加另外一种聚合物数量的机制以提供必要的强度来维持细胞的完整性[4]。甘露聚糖的成分是甘露糖蛋白，约占细胞壁干质量的35%～60%。研究者在透射电镜下观察细胞壁不同组分的超微结构，发现部分几丁质和β-1，3葡聚糖绞索联系构成细胞壁电子透明内层结构，而位于细胞壁最外层的甘露糖蛋白也称做细胞壁蛋白(cell wall protein,CWP)，在透射电镜下呈现出纤维状、棉絮状的结构，CWP决定了细胞壁的孔隙性，其含量随着真菌活性的不同而改变，甘露糖蛋白在对宿主细胞识别、粘附以及激发宿主的免疫应答过程中均发挥重要的作用[4]。

光动力疗法是一种联合应用光敏剂及相应光源通过光动力学反应选择性破坏靶组织的一种非侵袭性的全新治疗技术[5]。光动力反应的基本过程为靶细胞通过摄取外源性光敏剂或光敏剂前体进入细胞后经内源性途径产生光敏分子，光敏分子受到相应波长的光照射，吸收光子能量后由基态跃迁至不稳定的三重态，然后迅速经过物理或化学退激过程释放能量而返回至基态。物理退激过程可产生荧光，可通过分析荧光光谱对疾病进行诊断；化学退激过程中，处于三重态的光敏分子经2种光动力反应机制分别将电子和能量传递给周围的生物分子：Ⅰ类光动力反应，与周围的物质作用，产生具有细胞毒性的自由基；Ⅱ类光动力反应，与氧分子作用产生单态氧，这些活性氧簇能与多种生物大分子发生相互作用，产生细胞毒性，从而导致细胞受损甚至死亡，达到治疗作用[6]。细胞内多种细胞器可成为单态氧导致的光动力氧化作用的靶器官。其中包括失活的酶、其他蛋白质类和过氧化脂质类，最终引起细胞膜、溶酶体、线粒体的裂解[7]。可见由激活的光敏剂产生的单态氧是一种非特异性氧化剂，且细胞对其不存在防御作用[8]。抗氧化酶如过氧化物酶、过氧化氢酶可抵御某些反应活性氧(reactive oxygen species,ROS)，但是不能抵御单态氧，单态氧甚至可使抗氧化酶失活，如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶[7]。

光敏剂5-氨基酮戊酸被细胞摄取后，经过一系列酶促反应，最后在线粒体内生成光敏物质原卟啉Ⅸ，后者经光照后产生的ROS对细胞器产生非特异性光动力损伤作用，引起细胞膜、溶酶体、线粒体等的裂解。通过实验，笔者发现，经光动力处理后的白念珠菌的超微结构发生了改变。在透射扫描电镜下，可看到白念珠菌的细胞壁被破坏，结构不完整，细胞膜与细胞壁之间间隙大小不一，特别是“电子透明层”变得不均匀、厚薄不一，提示光动力对几丁质和β-1，3葡聚糖有明显损伤作用。由此推测，几丁质和β-1，3葡聚糖在光动力作用后，数量大幅减少，维持细胞壁完整性的刚性骨架被破坏，细胞壁变得疏松、不完整。本实验也发现，经光动力作用后，菌株的细胞壁最外层的纤维状、棉絮状的电子致密层比对照组菌株变薄，部分细胞可见细胞壁棉絮状致密外层局灶性缺失的现象，推测光动力同时破坏了甘露糖蛋白。Monfrecola等的研究结果显示，白念珠菌经5-氨基酮戊酸诱导的光动力处理后，细胞膜被破坏，细胞壁肿胀，部分甚至缺如[9]。本实验也显示，菌株的细胞膜部分或完全缺失，呈溶解状，与上述研究结果类似。二者的差异性考虑是由实验条件及参数设置不同造成的，但大体上的改变是相符的。以上改变对细胞的活性、繁殖及毒力的影响具体有多大，目前还不清楚，有待进一步深入研究。但是，5-氨基酮戊酸诱导的光动力有望通过特异性改变真菌细胞的超微结构而影响其活性，从而降低其致病力，而对人类宿主细胞又几乎不具有毒副作用。据此光动力疗法有望成为一种新的有效、低毒的抗真菌疗法。

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[8]Donnelly R F,Mc Carron P A,Tunney M M.Antifungal photodynamic therapy[J].Microbiol Res,2008,163:1-12．

[9]Monfrecola G,Procaccini E M,Bevilacqua M,et al.In vitro effect of 5-aminolaevulinic acid plus visible light on Candida albicans[J].Photochem Photobiol Sci,2004,3(5):419-422．

(编辑：何佳凤)

Influence of 5-aminolevulinic Acid Photodynamic on Ultrastructure of Candida Albicans

ZHANG Ziping,ZHONG Xi,CHENG Bo,SU Huichun,CHEN Lihong

Institute of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China

ObjectiveTo observe the influence of 5-aminolevulinic acid photodynamic on ultrastructure of Candida albicans and to provide a theoretical basis forstudyingantifungal mechanism of ALA-PDT.MethodsUltrastructure of Candida albicans in experimental group(subjected to 5-aminolevulinic acid photodynamic)and in control group were observed under transmission electron microscope.ResultsUnder transmission electron microscope,the cells,after being subjected to 5-aminolevulinic acid photodynamic,presentedswelling deformation,showing incomplete walland membrane structure.The cell wall was loose,and the gap between the cell membrane and cell wall varied in sizes.We also observed,in some cells,incomplete cell wall structure with electron dense layers and cell membrane discontinuation at localized area.Conclusions5-aminolevulinic acid photodynamic may play a role in the structure of cell wall of Candida albicans.

aminolevulinic acid; photochemotherapy; Candida albicans; microscopy,electron,transmission

2016-03-30

福建省中青年教师教育科研项目(JB13394)

福建医科大学 附属第一医院皮肤科，福州350005

张子平(1962-)，男，主任医师.Email:2558080320@qq.com

R379.4；R453；R739.5；R75；R916.4；R977.4

A

1672-4194(2016)04-0260-04