钩吻素子对小鼠佐剂性关节炎的治疗作用

杨　渐，蔡宏达，陈泽鸿，方梦寒，俞昌喜



钩吻素子对小鼠佐剂性关节炎的治疗作用

杨渐1，蔡宏达2，陈泽鸿1，方梦寒1，俞昌喜1

目的观察钩吻素子对小鼠佐剂性关节炎的治疗作用。方法筛选成功建立佐剂性关节炎模型的小鼠，随机分为模型组、钩吻素子高(20 mg/kg)、中(4 mg/kg)、低(0.8 mg/kg)剂量及阳性对照药吲哚美辛处理组(10 mg/kg)，每组12只，另设置12只未免疫正常小鼠为对照组。建模后第8天起，以灌胃方式给药，每天1次，连续10 d。以小鼠体质量、注射足厚度、热辐射痛阈热缩足反射潜伏期(PWTL)以及组织病理学变化等为指标，观察钩吻素子的治疗作用。结果小鼠建模后出现显著的体质量减轻、注射足厚度增加、热辐射痛阈下降，苏木精-伊红(H-E)染色显示关节结构破坏、滑膜增生以及炎症细胞浸润。钩吻素子灌胃后，小鼠体质量增加，显著高于模型组，注射足厚度显著小于模型组，PWTL显著高于模型组，作用呈剂量依赖性。H-E染色显示钩吻素子处理组小鼠踝关节的炎性细胞浸润及滑膜增生、骨质破坏等得到改善。结论钩吻素子对小鼠的佐剂性关节炎具有治疗作用。

钩吻；钩吻碱；吲哚生物碱类；关节炎，实验性；关节炎，类风湿；小鼠

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜病变为主的自身免疫性疾病，主要症状包括关节僵硬、红肿、疼痛及畸形，可伴有体质量减轻、低热、疲乏等，具有很高的致残率[1]。临床上常用的抗RA药物疗效相对有限，不良反应较多。虽然近年来不断涌现的生物制剂对RA的治疗效果有明显的提高，但也存在价格昂贵、易降解、引发严重感染和肿瘤风险等缺点，因此新型抗RA药物仍有待于研发[2-4]。

我国中草药资源丰富，在中草药中寻找具有治疗RA功效的药用活性物质是发现新型抗RA药物的一个重要途径。钩吻素子是马钱科植物钩吻(Gelsemium elegans Benth.)所含吲哚类生物碱中含量最高且毒性相对较小的一种有效成分[5]，具有调节免疫及抗炎镇痛等效应[6-7]，但其是否可用于RA的治疗尚不明确。为探讨钩吻素子对RA是否具有治疗作用，本研究选用一种较为常用的RA动物模型，即佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)模型[8]，观察钩吻素子对RA的治疗作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物雄性昆明种小鼠，体质量18～23 g[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2009-0005]。光暗周期12/12 h下恒温(23±2)℃、恒湿(50±5)%环境饲养，自由饮水，每次给药前12 h禁食。所有动物实验操作均遵守国际与本地实验动物使用和保护委员会颁布的相关条例。

1.1.2试剂钩吻素子粉剂由福建医科大学药学院神经药理课题组提供，超高效液相测定纯度99%(图1)，盐酸溶解后以氢氧化钠调节pH为7.0，而后以生理盐水定容并配制为终浓度分别为0.08,0.4及2 mg/mL的溶液；吲哚美辛片剂(25 mg/片，上海九福药业)；完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；卡介苗冻干粉剂(上海生物制品公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1建立小鼠AA模型参照文献[9]方法，将卡介苗置于80 ℃恒温水浴1 h后与完全弗氏佐剂充分乳化(终浓度为5 mg/mL)，以微量注射器注射于小鼠右侧足底(20 μL/只)建立AA小鼠模型。以体质量变化为指标观察小鼠全身反应，足厚度为指标观察模型鼠后足肿胀，热刺激缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)为指标观察模型鼠后足疼痛，并以苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色法观察模型鼠注射足关节的病理变化。

1.2.2测定小鼠足跖厚度为观察模型鼠后足肿胀情况，参照文献[9]，使用游标卡尺测量小鼠后足跖部厚度，每次测量3次，取平均值。

1.2.3测定小鼠后足热辐射痛阈为观察模型鼠后足疼痛情况，以热刺激痛仪(PL-200型；成都泰盟科技有限公司)测定其PWTL，测定时维持环境室温(22±1)℃，湿度(55±10)%，调节仪器发热功率至23 W并预热30 min，将动物置于测试笼中适应至其安静后，将刺激光源对准模型鼠注射足底中部，从开始照射至小鼠出现抬腿回避的时间即为PWTL。给药期间测定时间为给药后30 min，设置切断时间为30 s以防止组织损伤，每只动物测定3次，每次间隔6～8 min，结果取其平均值。

1.2.4H-E染色小鼠处死后立即剪取踝关节，以4%多聚甲醛溶液固定后，用10%的乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)溶液脱钙20 d，每周更换EDTA溶液1次；脱钙后以干净双蒸水浸洗标本2～3 h，每10 min换液1次，而后行石蜡包埋与切片(厚度5 μm)，H-E染色；于光学显微镜下观察关节滑膜增生，炎性细胞浸润以及软骨骨质破坏及关节周围组织水肿等病理学变化。

1.2.5分组及建模以非甾体类药物吲哚美辛为阳性对照药，在小鼠AA模型上观察钩吻素子的治疗作用。小鼠于建模前1天测定基础痛阈，PWTL<8 s者予以剔除。按照上述方法建立AA模型，模型建立成功标准为注射后第8天注射足厚度增加>0.5 mm且PWTL<8 s。选择造模成功的小鼠随机分为5组，每组12只。依次为模型组、钩吻素子高剂量(20 mg/kg)处理组、钩吻素子中剂量(4 mg/kg)处理组、钩吻素子低剂量(0.8 mg/kg)处理组以及吲哚美辛处理组(10 mg/kg)；另有未免疫正常小鼠12只设置为对照组。致炎后第8天开始按0.1 mL/10 g体积灌胃给药，每天1次，连续10 d，对照组与模型组小鼠均按相同体积给予生理盐水。于建模后第4,8,12,16,18天分别测定小鼠体质量、足厚度及PWTL，实验结束后处死小鼠，取踝关节进行组织病理学检查。

2　结　果

2.1小鼠AA模型的建立本研究共使用基础痛阈合格的小鼠100只，致炎后第2天起即出现后足红肿及PWTL的下降，但部分小鼠的炎症发展具有自限性，按照1.2.5所述标准进行筛选，建模成功率为67%。

2.2钩吻素子对AA小鼠体质量变化的影响建模前各组小鼠体质量无差异，建模后模型组小鼠出现活动减弱，食量减少，体质量增长缓慢，而后出现体质量减轻，建模后第8,12,16及18天均显著低于对照组小鼠(P<0.01)。钩吻素子可呈剂量依赖性抑制模型鼠体质量的减轻，钩吻素子高剂量处理组建模后第12天起、中剂量处理组第16天起小鼠体质量显著高于模型组小鼠(P<0.01或0.05)，并出现体质量增加，吲哚美辛亦可显著抑制模型小鼠体质量的减轻(图2)。

2.3钩吻素子对AA小鼠后足肿胀的抑制作用建模前各组小鼠注射足厚度无显著性差异，建模后第4天起模型组小鼠注射足即出现明显的炎症肿胀，其厚度显著大于对照组(P<0.01)，并呈进行性加重。钩吻素子可显著抑制模型鼠注射足炎症肿胀，作用呈剂量依赖性，建模后第12天起钩吻素子高、中、低剂量处理组足厚度均显著小于模型组(P<0.01或0.05)。吲哚美辛对模型鼠的足肿胀亦有显著的抑制作用(图3)。

2.4钩吻素子对AA小鼠注射足热痛敏的缓解作用建模前各组小鼠热辐射痛阈无显著性差异，建模后第4天起模型组小鼠即出现注射足PWTL的显著缩短(P<0.01)，提示注射足出现热痛敏，并持续2周以上。钩吻素子灌胃可升高模型鼠注射足PWTL，作用呈剂量依赖性，建模后第12天起，钩吻素子处理组小鼠注射足PWTL显著高于模型组(P<0.01或0.05)，提示钩吻素子对模型鼠注射足热痛敏具有缓解作用。吲哚美辛亦体现出对模型鼠注射足热痛敏的缓解作用(图4)。

2.5钩吻素子对AA小鼠踝关节组织病理改变的影响H-E染色显示，正常组小鼠踝关节结构(箭头所示，下同)清晰，滑膜组织正常，未见增生及炎性细胞浸润(图5A)；模型组小鼠关节滑膜组织中有大量炎性细胞浸润，滑膜组织明显增生，排列紊乱，关节间隙变窄，部分关节软骨破坏(图5B)；低剂量钩吻素子处理组小鼠对关节组织病理学改变无明显改善作用，关节间隙仍不清晰，可见炎症细胞浸润(图5D)；吲哚美辛组(图5C)及钩吻素子中剂量(图5E)、高剂量(图5F)处理组小鼠踝关节病变较模型组有明显减轻，关节间隙虽仍有轻度狭窄但结构较为清晰，炎性细胞浸润与滑膜增生情况均有改善。

3　讨　论

AA又称为弗氏佐剂关节炎，是由Pearson等于20世纪50年代创立的一种免疫性关节炎动物模型，在临床表现、病理学改变及发病机制等方面与人类RA有许多相似之处，发展至今已成为筛选研究治疗RA药物较为理想的动物模型之一[11-12]。本研究在昆明鼠足底注射弗氏佐剂，以足厚度观察注射足肿胀程度，以PWTL观察关节疼痛，以体质量的变化观察模型小鼠全身情况，并通过H-E染色观察小鼠关节结构的改变。结果发现，AA模型小鼠出现了RA样的炎症病变，表现为以注射足踝关节为主的炎症性红、肿、痛等，与对照组比较，出现了显著的注射足肿胀与热痛敏，组织病理学检查有关节结构破坏及炎症细胞浸润，并有体质量减轻的全身表现，与文献报道相符[9,13]，提示已成功建立AA小鼠模型。

与模型组比较，AA小鼠钩吻素子处理组小鼠注射足厚度减小，热辐射痛阈升高，提示模型小鼠的足肿胀及热痛敏得以缓解，这些作用呈剂量依赖性，提示钩吻素子对AA小鼠模型体现抗炎与镇痛的作用，连续给药后模型小鼠后足炎症的进展被抑制。病理检查提示，钩吻素子(4，20 mg/kg)处理组AA小鼠后足踝关节结构的破坏及炎症细胞的浸润也有一定程度减轻。此外，体质量改变也是评价AA疾病进程和对抗炎药物治疗反应的一个指标。钩吻素子能够抑制模型鼠的体质量减轻，提示其对模型的全身反应也有一定改善作用。

在上述对AA模型的评价指标中，炎症、疼痛及关节破坏是RA的主要临床特点，其中炎症与其引起的疼痛是影响RA患者生活质量的一个重要因素，长时间的疼痛还可使患者产生焦虑、抑郁、烦躁等情绪，并可导致睡眠障碍[14]，因此在RA的治疗中对疼痛的缓解尤为重要。钩吻总碱的镇痛作用早有报道，对多种疼痛均有良好疗效，其痛域提高百分率仅低于吗啡而高于汉防己、延胡索等其他生物碱[15]，但由于其毒性强而受到限制。从钩吻总碱中寻找并分离出有活性而毒性相对较低的单体是突破其应用限制的一个途径，神经药理课题组利用先期建立的分离纯化工艺获得了多种高纯度钩吻生物碱单体如钩吻素子、钩吻素己及1-甲氧基钩吻碱等[16-17]，并进行了相关药效学及药动学特性等方面的研究。结果发现：(1)钩吻素子毒性低于钩吻总碱，小鼠皮下注射钩吻素子半数致死量(median lethal dose，LD50)为99.0 mg/kg，约为总碱的1/58，小鼠灌胃给药LD50为203.8 mg/kg，约为钩吻总碱的1/92.6[18]；(2)钩吻素子也具有较强的镇痛效应且无吗啡样药物依赖性[19]，其对AA小鼠注射足热痛敏的改善作用也与课题组前期报道相符；(3)钩吻素子还具有抗焦虑作用[20]，若用于抗RA治疗，可能有利于缓解RA患者由于疼痛而引起的紧张、焦虑情绪。上述研究提示，钩吻素子对佐剂诱导的小鼠关节炎具有治疗作用，可能可以开发成为抗RA的新型治疗药物，相对于钩吻总碱应更具有应用前景及开发价值。而其对RA的治疗效应及可能的作用机制还有待于进一步研究确证。

综上所述，钩吻素子可以减轻AA小鼠的足肿胀并缓解其疼痛，同时减轻其关节破坏，对小鼠的佐剂性关节炎具有治疗作用。本研究为钩吻素子在抗RA方面可能的临床应用提供了实验室数据支持。

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(编辑:张慧茹)

Therapeutic Effect of Koumine on Adjuvant Arthritis in Mice

YANG Jian1,CAI Hongda2,CHEN Zehong1,FANG Menghan1,YU Changxi1

1.College of Pharmacy,Fujian Medical University,Fuzhou 350108,China；2.Department of Anesthesiology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China

ObjectiveTo examine the therapeutic effect of koumine on adjuvant arthritis in mice.MethodsEight days after immunization,mice with adjuvant arthritis received koumine (0.8,4,or 20 mg/kg),or indomethacin (10 mg/kg) as control through gastric gavage for 10 consecutive days.Body weight,injected paw thickness and paw withdrawal thermal latency (PWTL) were examined prior to the immunization and after the initiation of drug treatments on alternate days and followed by histological examination.ResultsAfter immunization,the body weight decreased,the injected paw thickness increased and the PWTL decreased in mice with adjuvant arthritis.Histological examinations showed that the immunized mice exhibited apparently joint structure destruction,synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration.Repeated intragastric administrations of koumine significantly attenuated the above physical and hyperalgesia changes observed in arthritic animals in a dose-dependent manner and inhibited the histopathological lesion.ConclusionKoumine can effectively attenuate adjuvant arthritis in mice.

gelsemium elegans；gelsemine；indole alkaloids；arthritis,experimental；arthritis,rheumatoid；mice

2016-06-16

福建省自然科学基金项目(2016J01367)

福建医科大学1.药学院，福州350108；2.附属第一医院 麻醉科，福州350005

杨渐(1982-)，男，讲师，理学硕士，福建医科大学2012级博士研究生

俞昌喜.Email：changxiyu@mail.fjmu.edu.cn

R332；R684.3；R593.22；R917.78

A

1672-4194(2016)04-0217-05