乙酰化微管蛋白α在肺、肝和肾纤维化中的表达及其病理意义

耿玉聪，高学敏，李世峰，徐丁洁，徐　洪，杨　方



乙酰化微管蛋白α在肺、肝和肾纤维化中的表达及其病理意义

耿玉聪1，高学敏1，李世峰1，徐丁洁2，徐洪1，杨方1

目的研究乙酰化微管蛋白α(Ac-α-Tub)在动式染尘矽肺大鼠肺纤维化模型、单侧输尿管结扎(UUO)肾纤维化模型和硫代乙酰胺(TAA)致肝纤维化模型中的表达及其病理意义。方法采用动式染尘构建矽肺大鼠模型，采用UUO构建肾纤维化模型，采用TAA构建肝纤维化模型。采用免疫组织化学染色观察Ac-α-Tub及波形蛋白(vimentin)在组织中的差异表达，采用HistoQurst图像分析软件对免疫组织化学结果进行分析。结果随着染尘时间的延长，vimentin的阳性表达率明显上调，而Ac-α-Tub的阳性表达率明显下调；在肝、肾纤维化中，随着造模时间的延长，vimentin和Ac-α-Tub的阳性表达率均明显上调。结论Ac-α-Tub在肺、肝和肾纤维化中阳性细胞的定位及临床病理意义均具有差异，其缺失表达可能提示肺纤维化进展，而在肝、肾纤维化过程中则可能起到相反作用。

微管蛋白；乙酰化作用；纤维化；免疫组织化学；染色与标记

细胞骨架蛋白(包括微管、微丝和中间丝)在维持细胞的形态、调控其可塑性以及细胞的粘附、迁移、物资运输和增殖方面发挥了重要的调节作用。本课题组前期研究发现，乙酰化微管蛋白(acetylated α-tubulin,Ac-α-Tub)、微丝蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和中间丝蛋白波形蛋白(vimentin)在矽肺大鼠模型中差异表达，其中α-SMA是公认的肌成纤维细胞标记物，vimentin在肺组织中主要标记了活化的巨噬细胞，二者是矽肺大鼠纤维化较为明确的标记物，反映了矽肺大鼠纤维化的病变程度；而作为支气管纤毛上皮细胞标记物的Ac-α-Tub，可在正常肺泡壁的多种细胞(肺泡上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞)中阳性表达，而在矽结节及间质纤维化区域缺失表达，可能是矽肺纤维化另一个新的标记物[1-2]。然而，Ac-α-Tub在其他纤维化模型中是否也具有类似的表达特点，目前仍未所知。因此，本实验以Ac-α-Tub作为研究靶向，采用免疫组织化学染色方法检测其在动式染尘构建的矽肺大鼠模型、单侧输尿管结扎(unilateral ureteral occlusion,UUO)构建的肾纤维化模型和硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)构建的肝纤维化模型中的差异表达，采用HistoQurst图像分析软件进行图像分析并探讨其病理学特点，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物成年清洁级雄性Wistar大鼠72只，体质量(180±10)g(170～190 g)[北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK京2009-0003]，饲养于华北理工大学动物实验中心屏障实验室(许可证号：SYXK冀2010-0038)，自由饮食进水。

1.1.2试剂TAA(美国Sigma公司)；伊红染液(BA4041)、苏木精(BA4024，珠海BASO生物技术有限公司)；Ac-α-Tub鼠抗(sc-23950，美国Santa Cruz公司)；vimentin兔抗(Ab92547，美国Abcam公司)；通用型免疫组织化学试剂盒(PV-6000)及DAB显色试剂盒(ZLI-9032,北京中杉金桥)。

1.2方法

1.2.1构建矽肺纤维化模型采用动式染尘控制系统(HPOE-ED8050)构建矽肺纤维化模型，在温度20～25 ℃、湿度70%～75%、柜内压力-50～+50 Pa、氧含量20%、SiO2流速3.0～3.5 mL/min、SiO2浓度2 000 mg/m3的条件下染尘，3 h/d，分别于4，8和16周处理(每组n=6)。对照组(n=6)未做处理。

1.2.2构建肾纤维化模型大鼠麻醉后，分离左侧输尿管，用4-0慕丝线双结扎输尿管的近膀胱端，双结扎中间离断输尿管以防逆行性感染，肌肉、皮肤缝合。于1，2，3周处理(每组n=6)。对照组(n=6)暴露左侧输尿管后不结扎，之后缝合[3]。

1.2.3构建肝纤维化模型腹腔注射TAA(每次200 mg/kg)，每周3次，持续1，3，6周处理(每组n=6)。对照组(n=6)腹腔注射生理盐水，剂量及时间同模型组。

1.2.4免疫组织化学检测Ac-α-Tub、vimentin的表达石蜡切片常规脱蜡至水，高压修复，H2O2去除内源性过氧化物酶，一抗(1∶200)4 ℃过夜，二抗37 ℃ 20 min，DAB显色，苏木精轻度复染，中性树胶封片。采用HistoQuest全景组织细胞定量分析系统(奥地利TissueGnostics公司)分析图像。首先进行全景组织扫描(×200)，随机选取5个视野(1 mm2)进行苏木精和DAB染色拆分，依据软件的回溯功能，设定阳性细胞参数(包括苏木精染色平均强度、DAB染色平均强度、染色面积、形状比斜率等)，自动分析后获得阳性细胞百分比[4]。由于Ac-α-Tub在肺组织支气管纤毛上皮、肾小球区域恒定表达，因此在分析时需去除该区域。

2　结　果

2.1Ac-α-Tub在动式染尘肺纤维化模型中的差异表达H-E染色结果显示，染尘4周偶见细胞性矽结节的形成，染尘8周可见多个孤立的细胞性矽结节，而染尘16周见多个细胞性矽结节的融合，可见细胞纤维性矽结节的形成。与原有支气管灌注SiO2构建的大鼠矽肺模型一致，Ac-α-Tub可强阳性表达于支气管纤毛上皮细胞，在正常肺泡组织中的多种细胞成分(肺泡上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞)中均有阳性表达，而在矽结节及间质纤维化区域中缺失表达(图1)。vimentin可表达于间质的成纤维细胞，且强阳性表达于巨噬细胞。图像分析结果显示，在对照组及染尘4，8，16周组中，Ac-α-Tub阳性细胞百分比逐渐增高，其中染尘8，16周组与对照组比较，差别均具有统计学意义(P<0.05，表1)。而vimentin阳性细胞百分比随着染尘时间的延长而增高，染尘各时间组与对照组比较，差别均具有统计学意义(P<0.05)。

表1　Ac-α-Tub、vimentin在大鼠矽肺模型中的阳性细胞表达Tab 1　The positive expression rate of Ac-α-Tub and vimentin in silicotic rats　%

n=6.Ac-α-Tub:乙酰化微管蛋白；vimentin：波形蛋白.与对照组比较，☆：P<0.05.

2.2Ac-α-Tub在UUO大鼠肾纤维化模型中的差异表达H-E染色结果显示，对照组无明显病理改变，而UUO 1周组肾小球结构基本正常，肾小管扩张，肾间质略增宽，间质出现较多炎细胞浸润；2，3周组可见肾小囊增宽，梗阻区域肾小管萎缩，多见肾间质细胞增殖，部分肾小球萎缩。免疫组织化学染色结果显示，Ac-α-Tub可阳性表达于肾小球，同时在部分肾小管上皮细胞中阳性表达，随着造模时间延长，其在梗阻/纤维化区域的肾小管上皮细胞阳性表达，且阳性表达率逐渐上调，UUO 1，2，3周组与对照组比较，差别均具有统计学意义(P<0.05，图2)。而vimentin在对照组仅表达于肾小球系膜细胞，偶见肾小管间质细胞阳性表达；在UUO组中的间质纤维化区域和肾小管上皮细胞中均有明显的阳性表达，且随病变程度的加重而增加，UUO 1，2，3周组与对照组比较，差别均具有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2Ac-α-Tub、vimentin在UUO模型中的阳性细胞表达

Tab 2The positive expression rate of Ac-α-Tub and vimentin in UUO rats%

n=6.Ac-α-Tub:乙酰化微管蛋白；vimentin：波形蛋白; UUO:单侧输尿管结扎.与对照组比较，☆：P<0.05.

2.3Ac-α-Tub在TAA大鼠肝纤维化模型中的差异表达H-E染色结果显示，对照组无明显改变。TAA染毒1周可见大量肝细胞空泡样变性、坏死；3周可见门管区及其周围组织星芒状纤维化；6周可见纤维化间隔形成，肝小叶结构凌乱，可见假小叶形成。在对照组中偶见Ac-α-Tub阳性表达的肝星状细胞，随着染毒时间增加，Ac-α-Tub阳性表达的星状细胞数目增多，多集中于纤维化区域，其在对照组及TAA 1，3和6周组中的阳性表达率逐渐增高(图3，表3)，TAA 1，3，6周组与对照组比较，差别均具有统计学意义(均为P<0.01)。vimentin亦可阳性标记肝星状细胞，随着染毒时间延长，能够较为明确的标记纤维化区域，阳性表达率随造模时间延长而逐渐增多，TAA 1，3，6周组与对照组比较，差别具有统计学意义(均为P<0.01)。

表3Ac-α-Tub、vimentin在TAA模型中的阳性细胞表达

Tab 3The positive expression rate of Ac-α-Tub and vimentin in TAA rats%

n=6.Ac-α-Tub:乙酰化微管蛋白；vimentin：波形蛋白；TAA：硫代乙酰胺.与对照组比较，☆：P<0.05.

3　讨　论

微管蛋白作为细胞骨架蛋白的重要组成部分，在稳定细胞形态、可塑性，参与调控细胞迁移、粘附、分裂、细胞内的物质运输及信号的传递等方面发挥着重要的调控作用。微管蛋白的氨基酸序列和微管结构在进化上高度保守，其功能的多样性主要取决于翻译后修饰作用，其中乙酰化修饰对于维持微管蛋白聚合的稳定具有重要意义。研究证明，Ac-α-Tub主要表达于具有纤毛上皮、鞭毛和轴突的组织或细胞中，在肺组织中可以作为支气管纤毛上皮细胞的标记物[5]。本课题组前期研究也发现，Ac-α-Tub主要强表达于脑组织，在食管、胃和大肠组织中多标记于神经细胞，在脾脏中可阳性表达于单核细胞，在主动脉、心脏和骨骼肌中不表达，而在矽肺大鼠模型(支气管灌注SiO2)中缺失表达，体外研究也显示，血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅱ诱导的肌成纤维细胞伴随Ac-α-Tub的表达下调[2]。在本研究中，采用动式染尘构建矽肺大鼠模型，能够出现“细胞性矽结节-细胞纤维性矽结节-纤维细胞性矽结节”逐渐进展的病理学特征。与本课题组以往研究一致，Ac-α-Tub在矽结节内及间质纤维化区域中缺失表达，相反vimenitn则在此区域内阳性高表达，提示Ac-α-Tub的缺失表达在矽肺大鼠模型中能够作为一个反映纤维化进展的指标。本研究结果显示，在肝、肾纤维化模型中，Ac-α-Tub所反映的差异表达与肺纤维化模型不同。在肾组织中，Ac-α-Tub常被用作初级纤毛的标记物，在肾组织缺血4 h和缺血后1 d内，Ac-α-Tub标记的初级纤毛长度缩短，而在缺血后8 d内逐渐升高，至16 d恢复至正常长度，且体外实验显示，处于增殖期的细胞初级纤毛长度短、成熟的细胞较分化状态的细胞长度短[6-7]。而在单肾切除模型中，由于尿液流体剪切力的增加，能够诱导近曲小管粘附连接蛋白E-钙黏蛋白、紧密连接蛋白ZO-1表达的下调，同时伴有初级纤毛的缺失[8]。体外研究也显示，肾小管上皮细胞初级纤毛的缩短与抵抗自噬有关[9]。本研究中，Ac-α-Tub在对照组中阳性表达于肾小球细胞和远曲小管上皮细胞，而在UUO模型中还可表达于近曲小管上皮细胞，随病变程度增加而阳性表达增加，推测可能是梗阻性病变引起的一种适应性反应。本研究还发现，Ac-α-Tub可阳性表达于肝星状细胞，随着TAA肝纤维化模型的进展而阳性表达率明显上调。在酒精性肝病大鼠模型和体外肝细胞予以乙醇刺激，均能够显著诱导Ac-α-Tub表达的上调，推测可能是肝细胞对乙醇的一种应激性反应[10]。

体外研究显示，在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮A549细胞及人肺成纤维细胞、Ang Ⅱ诱导的内皮细胞迁移实验中，均发现α-Ac-Tub表达下调，与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肌成纤维细胞分化和内皮屏障功能障碍密切相关[11-13]。而在正常大鼠肾成纤维细胞中，TGF-β1能够促进微管蛋白mRNA水平表达的上调[14],提示α-Ac-Tub在纤维化疾病中的作用差异可能与组织特异性有关。同时，乙酰化是微管蛋白翻译后修饰动态的一种动态调控机制，而Ac-α-Tub是微管蛋白乙酰化的产物，参与了微管蛋白的聚合/解聚以形成细胞骨架或特定的细胞器(如纤毛、鞭毛、轴突等)，这是3个不同层次的概念，在纤维化疾病发生、发展中的具体作用机制仍需进一步研究探讨。本研究发现了Ac-α-Tub表达的组织特异性，且在不同器官的纤维化病变中，细胞定位和病理意义并不相同，其在肺纤维化中的缺失表达，在肝、肾纤维化中的高表达，值得进一步研究探讨。

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(编辑：何佳凤)

The Expression and Pathological Significances of Ac-α-Tub in Lung,Liver and Renal Fibrosis

GENG Yucong1,GAO Xuemin1,LI Shifeng1,XU Dingjie2,XU Hong1,YANG Fang1

1.Medical Research Center; 2.College of Chinese Traditional Medicine,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China

ObjectiveTo observe the expression and pathological significance of acetylated α-tubulin (Ac-α-Tub) in rats with silicosis,unilateral ureteral obstruction (UUO) and thioacetamide (TAA).MethodsSilicosis model was established with inhalation of d SiO2in a dynamic manner.Renal fibrosis model was established by UUO.Hepatic fibrosis model was established by TAA intraperitoneal injection.The expression of Ac-α-Tub and vimentin were measured by immunohistochemistry staining and analyzed by HistoQurst software.ResultsWith the time of dust exposure extended,the positive rate of vimentin was increased accompanyinga down-regulation of Ac-α-Tub.In the renal and hepatic fibrosis,the positive rate of Ac-α-Tub and vimentin was all increased with the extension of the time of models creation.ConclusionThere is a differential expression of Ac-α-Tub and pathological significance in lung,renal and hepatic fibrosis.The down-expression of Ac-α-Tub in silicosis,and up-expression of it in UUO and TAA in rats.

tubulin; acetylation; fibrosis; immunohistochemistry; staining and labeling

2016-04-16

国家自然科学基金(81472953)；河北省自然科学基金(H201409115)；河北省研究生创新项目(2015S04)

华北理工大学，唐山 0630001.医学实验研究中心；2.医学中医学院

耿玉聪(1989-)，女，华北理工大学2015级硕士研究生

杨方.Email:fangyang1955@163.com

R135.2；R693.2；R575.3；R977.6

A

1672-4194(2016)04-0232-05