牛至油对尖孢镰刀菌的超显微结构和侵染黄瓜植株体内酶活力的影响

高磊

摘要[目的]探讨天然植物提取物牛至油对黄瓜植株蔬菜致病真菌的抗菌作用及机制。[方法]利用透射电镜观察牛至油对尖孢镰刀菌的超显微结构的影响，并根据4种酶不同的活性，采用不同的方法测定喷洒牛至油的黄瓜叶片内4种酶活力。[结果]在透射电镜下观察发现牛至油处理后尖孢镰刀菌丝体和分生孢子结构均发生明显变化。牛至油处理7～28 d 4种酶活性逐渐增大，28 d后酶的活性逐渐降低。[结论]牛至油具有促进黄瓜植株体内酶活性以及抑制植物病原菌生长的作用。

关键词 牛至油；蔬菜；致病真菌；抑菌作用；酶活力

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）09-013-03

Abstract[Objective]To investigate the natural plant extracts oregano oil on the antibacterial effect of cucumber plant vegetables and mechanism of pathogenic fungi.[Method]Effects of oregano oil on the ultramicroscopic structure of Fusarium oxysporum were studied. According to four kinds of enzyme activities， different methods were used to determine the cucumber leaf spraying oregano oil in four kinds of enzyme activities.[Result]Observation under transmission electron microscope showed that mycelium and conidium structures of Fusarium oxysporum changed obviously. After treated by oregano oil for 7-28 d， the four kinds of enzyme activities gradually increased， and then decreased after 28 d.[Conclusion]Oregano oil promotes the in vivo enzyme activity of infected cucumber， and restricts the growth of plant pathogen.

Key words Oregano oil； Vegetables； Pathogenic fungi； Bacteriostatic action； Enzymatic activity

近些年，化學药品的大量运用给环境带来很大的压力，但是植物源农药有低毒、易降解、选择性强等优点，所以植物源农药对植物病害的研究已成为当前农药研究与科学的热点话题之一[1]。由于大多数植物提取物都具有抑菌作用，大量研究也表明植物提取物具有明显的抗植物病原真菌、细菌和虫害的作用。目前，国外已开发出许多植物源杀菌剂，国内对植物源提取物对植物病原真菌的抑制作用方面的报道较多，但在植物源杀菌剂的开发应用方面的报道较少[2]。笔者从植物体内酶活力和真菌细胞的超显微结构2个方面研究牛至油对侵染植株的抑菌机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品。

15 mol/L蛋氨酸（Met）缓冲液、0.1 mmol/L核黄素（VB2）溶液、0.05 mol/L愈创木酚溶液、008%H2O2、pH 8.8的硼酸缓冲液、pH 6.8的磷酸缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、0.1 mol/L邻苯三酚、0003 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、0.05 mol/L pH 5.5的醋酸、戊二醛、磷酸缓冲液、丙酮、醋酸异戊酯、氯化钠、PDA培养基、005%Tween 80、pH 7.8的磷酸缓冲液、0.1 mol/L氮蓝四唑（NBT）[3]。

1.1.2 主要仪器。

研钵、分光光度计、剪刀、水浴锅、离心机、试管、离心管、YX280手提式压力蒸气灭菌锅、超净工作台、GHP9160隔水式恒温培养箱、血球计数板等。

1.2 方法

1.2.1 尖孢镰刀菌的电镜观察。

制备含3.125 mg/L牛至油的培养基下培养96 h的尖孢镰刀菌菌块数块，用3%的戊二醛在室温下固定4～6 h，磷酸缓冲液（pH 6.8）冲洗数次，每次间隔30 min，然后经过一系列丙酮脱水，每次30 min，其中100%丙酮脱水3次，纯醋酸异戊酯置换2次，每次30 min，CO2临界点干燥、黏样、镀膜后，在扫描电镜下观察其超显微结构[4-5]。

1.2.2 4种酶活性的测定。

3株喷洒过牛至油的黄瓜，从喷洒药物后的第1天起，每7 d喷洒1次药物溶液，取1次材料，共取6次，每次取材的部位都要相近，将取回的材料带回实验室，备用；然后，再选几棵未感病的植株和感病的植株，分别取一定量的叶片作为试验材料，带回实验室备用。

4种酶反应体系及其吸收峰如表1所示。取0.29 g叶片在冰浴条件下分别提取4种酶的粗提液，分别取4种酶的反应体系和对照组在分光光度计下测定吸光度[3，6-10]。

2 结果与分析

2.1 牛至油对尖孢镰刀菌超显微结构的影响[11]

从图1可以看出，对照组中可以看到大小型分生孢子结构致密，细胞膜和细胞壁均匀完整，颜色较深；厚垣孢子呈较大的球形；菌丝和孢子切面的细胞壁完整，厚薄均匀，质地致密，细胞基质也均匀（图1A）。处理组，可以看到菌丝形态完全改变，多数菌丝干瘪，细胞壁变薄，菌体表面皱褶消失，大部分菌丝己无正常结构，并出现多处破坏和断裂，菌体内细胞内容物流失，大小分生孢子的细胞壁和细胞膜严重破坏，细胞壁剥脱和破裂，细胞膜大部分消失；厚垣孢子明显缩小，细胞壁变薄（图1a）[4-5，11-14]。

从图1可以看出，在分生孢子放大图中，对照组大小分生孢子细胞壁完整，厚薄均匀，质地致密，颜色深；小型分生孢子呈单胞，卵形；大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔，清晰可见（图1B）。在处理组中，可以看到细胞壁边缘模糊，细胞器明显减少，大部分溶解消失，在细胞内可见较大的空泡状结构，细胞基质变淡，可能由于胞内原生质大量外泄，外部物质也渗进细胞内，形成较大且大量的空腔，基本不能清楚观察到分生孢子的结构（图1b）。

从图1可以看出，厚垣孢子放大后，对照组细胞密度较大，细胞器丰富，胞质内清晰可见细胞核、囊泡和脂滴，并分布在细胞膜附近（图1C）；在处理组中，由于药物的作用，细胞膜和细胞壁结构变薄，不均匀，出现分层破裂，细胞内出现大量的液泡，且呈弥散性分布，颜色变浅，说明细胞膜破坏，大量的细胞外物质进入（图1c）。由于药物为脂溶性，可溶解细胞膜，导致细胞膜的部分破坏，细胞内容物流出，大量的胞外物质进入，导致细胞颜色变浅，出现液泡数量增加、变大。

2.2 牛至油对侵染黄瓜植株体内酶活力的影响 由于黄瓜植株本身就具有一定的抗病性，所以感病植株体内酶活力高于无病植株的酶活力。从图2～5可以看出，在感病的黄瓜植株上喷洒牛至油后，黄瓜植株体在牛至油的诱导下酶的活性显著增加，28 d酶的活性达到最大值，此后酶的活力逐渐降低[15-16]。

3 结论

该研究结果表明，牛至油处理后4～28 d 4种酶活性逐渐增大，28 d后酶的活性逐渐降低。喷洒牛至油溶液的黄瓜植株体内酶的OD值迅速升高，明显高于患灰霉病植株体内的酶的OD值，更高于正常植株的酶的OD值。

牛至油作用于尖孢镰刀菌后，在透射电镜下观察表明尖孢镰刀菌菌丝体和分生孢子结构均发生明显变化。厚垣孢子明显缩小，细胞壁变薄，细胞壁边缘模糊，细胞器明显减少，大部分溶解消失，在細胞内可见较大的空泡状结构，细胞基质变淡。这可能是因为胞内原生质大量外泄，外部物质也渗进细胞内，形成比较大且多的空腔。 究其原因，牛至油会导致尖孢镰刀菌菌丝形态完全改变，多数菌丝干瘪细胞壁变薄，菌体表面皱褶消失，并出现多处破坏和断裂，菌体内细胞内容物消失，大小分生孢子的细胞壁和细胞膜严重破坏，细胞壁剥脱和破坏，细胞膜大部分消失，大量的胞外物质进入，导致细胞颜色变浅，出现液泡数量增加、变大。

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