一种简易的甘蔗叶组织PCR模板制备方法

崔学强张树珍冯翠莲

（1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗研究中心 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101；2. 海南大学农学院，海口 570228）

一种简易的甘蔗叶组织PCR模板制备方法

崔学强1，2张树珍2冯翠莲2

（1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗研究中心 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101；2. 海南大学农学院，海口 570228）

以转基因甘蔗叶片为材料，少量嫩叶经碱并短暂高温处理，再中和，形成裂解混合物。直接以此为模板，转基因甘蔗外源基因bar、KP4、Cry1Ac-2A-gna融合基因及内源基因Shactin基因为靶基因，PCR扩增结果稳定、准确、重复性强，完全可以达到常规CTAB法提取的DNA扩增效果。用此方法制备的模板室温下2周之内，4℃、-20℃下一个月之内结果不变。经多种外源基因PCR反应的反复验证，证实了这种方法在转基因甘蔗检测中的广泛适用性。该方法快速制备PCR模板，无需DNA提取过程，具有使用样品量少，成本低、简便、快捷等优点。

甘蔗；碱裂解；中和；PCR模板；多重PCR

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是世界上一种重要的糖料作物和能源作物。培育高产、高糖、高抗的甘蔗新品种一直是甘蔗育种的主要目标。随着分子生物学的快速发展，转基因技术已成为甘蔗育种的重要方法。该技术通过将特定的基因导入甘蔗中，不仅可以使甘蔗的产量和品质性状得以提高，还能缩短育种的年限和周期［1］。目前，对转基因甘蔗植株的初步检测，国内外的实验室及检测部门运用最广泛的是PCR技术，该方法简便快捷，灵敏度高［2，3］。然而对转基因甘蔗进行PCR鉴定的前提是必须提取甘蔗植株基因组DNA，目前提取DNA的方法有很多种，使用最多的主要有CTAB法［4］、SDS法［5］及其改良法［6］。这些方法提取DNA所需材料多，步骤繁琐，费时费力且纯化程序复杂，因此当需要检测的转基因植株较多时，这些方法显得不太适用［7，8］。本实验拟研究出一种适用于转基因甘蔗检测的PCR 模板的快速制备方法。该方法快速制备PCR模板，无需DNA 提取过程，具有使用材料少，成本低、简便、快捷等优点。尤其适合材料比较宝贵的转基因甘蔗的预筛选和大样本量的PCR 检测，以期为转基因甘蔗分子育种的实际应用创造了条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 转KP4基因和转CryIAc-2A-gna融合基因甘蔗植株由本课题组利用农杆菌介导法获得，导入转基因植株的骨架载体为pCAMBIA3300，筛选基因为bar基因，对照植株为非转基因ROC-22植株。

1.1.2 主要试剂与仪器 2×Taq MasterMix购自康为世纪生物科技有限公司；2000 bp DNA Ladder Maker（M1101）购自东盛生物公司；琼脂糖购自Sigma公司；NaOH、HCl、Tris-HCl等购自广州化学试剂厂，均为分析纯；PCR扩增仪T1 Thermocycle（Biometra）；常温离心机（HETTICHD-78532）；恒温水浴锅（浦光HH-4）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 利用Primer Premier V 5.0分别设计合适引物，再利用Oligo V6.22对设计的引物进行评估排除引物之间的干扰，引物设计完成由上海生工合成（表1）。

表1 PCR引物序列及产物长度

1.2.2 转基因甘蔗PCR反应模板制备 取甘蔗幼嫩叶片0.5 cm2左右剪碎，放入1.5 mL的Eppendorf管中，加入100 μL 0.25 mol/L的NaOH，将此离心管插入沸水中煮30 s，取出加入100 μL 0.25 mol/L的HCl和50 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）再将该管放入沸水中孵育2 min，室温条件下10 000 r/min离心2 min，取上清2 μL直接作为模板进行PCR反应。

1.2.3 单PCR检测甘蔗转基因成分 以转KP4、CryIAc-2A-gna基因甘蔗的叶片浸出液为模板，分别用表1中相应引物进行PCR反应。PCR反应体系：2×Taq MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），模板2 μL，用ddH2O将终体积调整到20 μL。KP4和bar基因PCR扩增的退火温度为60℃，CryIAc基因和CryIAc-2A-gna基因的退火温度为56℃，Shactin基因退火温度为52℃，所有基因的退火时间均为1 min，PCR结束后取10 μL PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 多重PCR检测甘蔗转基因成分 选取6株转基因甘蔗作为实验材料，阴性对照为非转基因植株ROC-22，ddH2O作为空白对照，同时扩增KP4基因和bar基因及CryIAc-2A-gna基因、CryIAc基因和bar基因验证该方法在转基因甘蔗多重PCR检测上面的可靠性及适用性。（1）KP4基因、bar基因扩增体系：2×Taq MasterMix 10 μL，模板2 μL，KP4基因和bar基因上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），用ddH2O将终体积调整到20 μL。PCR扩增的退火温度为60℃，时间1 min，PCR结束后取10 μL PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。（2）CryIAc-2A-gna融合基因、CryIAc基因、bar基因扩增体系：2×Taq MasterMix 10 μL，模板2 μL，CryIAc-2A-gna融合基因、CryIAc基因及bar基因上下游引物各1 μL（10 μmol/L），用ddH2O将终体积调整到20 μL。PCR扩增的退火温度为56℃，时间1 min，PCR结束后取10 μL PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 碱处理叶片浸出液在不同温度下保存的DNA稳定性 将模板分别保存室温、4℃、-20℃的环境下，分别于7、15和30 d，进行单PCR扩增CryIAc-2A-gna融合基因检测模板DNA的稳定性。

1.2.6 转基因甘蔗用量对PCR模板制备的影响 以转KP4基因甘蔗幼嫩叶作为材料，嫩叶用量设置0.25、0.5、1、1.5、2和2.5 cm26个处理，用碱处理法制备PCR模板，制备方法同1.2.2，比较PCR扩增效果。

1.2.7 转基因甘蔗不同生长状态对PCR模板制备的影响 分别选取转KP4基因甘蔗生长初期幼嫩叶、生长中期绿色叶、生长中后期泛黄叶及生长后期枯黄老叶作为实验材料，用碱处理法制备PCR模板，制备方法同1.2.2，比较PCR扩增效果。

2 结果

2.1 单PCR检测甘蔗转基因成分

如图1所示，以碱处理的叶片浸出液为模板，不同基因引物进行单PCR反应扩增甘蔗转基因成分及内源基因，均能扩增出与目的基因预期大小相符的基因片段。

图1 单PCR检测甘蔗转基因成分电泳结果

2.2 多重PCR反应检测甘蔗转基因成分

如图2-A所示，以CTAB法提取的模板为阳性对照，6株转KP4基因植株碱处理的叶片浸出液为模板，同时加入KP4基因及bar基因引物，均能扩增出与阳性对照大小相同的基因片段。如图2-B所示，以转CryIAc-2A-gna基因植株碱处理的叶片浸出液为模板，同时加入CryIAc基因、bar基因及CryIAc-2A-gna基因引物，均扩增出了与阳性对照大小相同的基因片段。

图2 多重PCR反应检测甘蔗转基因成分电泳结果

2.3 碱处理叶片浸出液在不同温度下保存对实验结果的影响

碱处理的叶片浸出液分别保存于常温、4℃、-20℃条件下，3种条件下保存7 d的模板均能扩增出目的基因片段且扩增结果无显著差异（图3-A）；室温保存15 d的模板有部分扩增产生了杂带，未能扩增出目的基因片段，而4℃、-20℃保存的模板均能扩增出特异的目的基因片段（图3-B）；室温保存30 d的模板均扩增出非特异条带，未能扩增目的基因片段，4℃、-20℃保存的模板仍可扩增出特异的目的基因片段（图3-C）。

图3 模板DNA在不同温度下保存7 d（A）、15 d（B）和30 d（C）的PCR扩增电泳图

2.4 转基因甘蔗不同生长状态及不同用量对实验结果的影响

如图4所示，对样品不同生长状态下的叶片制备的模板进行KP4基因及bar基因的扩增结果表明，幼嫩叶扩增条带最亮，随着叶片的老化，扩增条带渐暗，叶片成枯黄时虽能扩增条带，但条带已很模糊。对不同样品用量制备的模板进行KP4基因（图4-A）及bar基因（图4-B）的扩增结果表明：取0.25 cm2左右的嫩叶剪碎制取的模板扩增条带较不清晰，叶面积在0.50-2.5 cm2之间制备的模板扩增结果无显著差异。

图4 样品不同生长状态及不同用量所制取模板的PCR扩增图

3 讨论

本研究的出发点是为大批量的转基因甘蔗建立一种简便、快捷的检测方法，为甘蔗分子育种工作奠定基础。运用本实验的方法仅需要取幼嫩叶片微量的叶尖即可进行上百次的PCR反应，同时碱处理法制备PCR模板仅需加热和中和两个过程，区别于传统的CTAB法和SDS法，可以省去低温研磨、DNA抽提等繁琐步骤，虽然此方法制备的模板可能含有蛋白质、盐类等杂质，但通过实验对单基因和多基因扩增实验反复验证，证明其在转基因检测中的可靠性。该方法在转基因水稻［9，10］、小麦［11］检测中已有相关文献报道，并在检测中得到了实际运用。针对甘蔗快速制备PCR模板的方法之前已有文献报道，如陈忠良等［12］用于甘蔗SSR-PCR模板制备采用的改良SDS法、DNA快速提取法；陈平华等［13］快速制备大批量甘蔗模板的碱裂解叶片法等。陈忠良等采用的改良SDS法在传统SDS法基础上进行了操作步骤的简化，DNA快速提取法则是直接用提取液来处理甘蔗叶片，之后在处理液中加入蛋白酶K进行水浴和冰浴处理，离心取上清并加入RNaseA，最后即可制取模板。这两种方法与本实验的碱裂解法相比操作步骤相对繁琐，成本较高，但其具有制取的模板所含杂质较少的优点。陈平华等［13］采用的碱裂解叶片法与本实验的方法有许多相似之处，但是采用的裂解液与中和液有明显区别，其所用裂解液为KOH与Tween-20的混合液，中和液为Tris-HCl与EDTA的混合液，而本实验采用的裂解液NaOH溶液，中和液为HCl和Tris-HCl。陈平华等的方法与本实验方法相比所用试剂较多，成本较高但与本实验扩增效果无明显差别。

实验在样品不同生长状态下制备模板扩增结果表明，幼嫩叶较宜制备模板。其原因可能是幼嫩叶所含DNA量大，加热处理细胞易破裂，而随着叶片的衰老，其体内的DNA出现了一定程度的降解，同时DNA从细胞中释放的难度也有所加大。对样品用量研究表明，0.5 cm2左右嫩叶就能满足实验的要求，且随着样品用量的增加模板扩增结果并无显著变化。其原因可能是在提取试剂一定的情况下，样品量的加大并不能使制取的模板量增大。对模板稳定性的研究结果表明，如果模板放置于室温条件下稳定性较差，其主要原因可能是室温条件，利于菌类生长，导致模板的降解。4℃、-20℃的条件较常温不利于菌的生长，同时较低的温度更有利于稳定模板DNA的结构，一般能保存较长时间。本实验对条件的摸索确定将为后期的研究工作奠定基础，提供参考。

4 结论

以转基因甘蔗叶片为材料，0.5 cm2左右嫩片经碱并短暂高温处理，再中和，形成裂解混合物。直接以此为模板，转基因甘蔗外源基因及内源基因基因扩增结果稳定、准确、重复性强。用此方法制备的模板室温下2周之内，4℃、-20℃下一个月之内结果不变。本方法制备的甘蔗叶组织模板可用于后续转基因甘蔗检测。

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［13］陈平华， 王恒波， 许莉萍， 等. 碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究［J］. 热带作物学报， 2010， 3：422-429.

（责任编辑 狄艳红）

A Simple Method for Preparing PCR Template of Sugarcane Leaf Tissue

CUI Xue-qiang1，2ZHANG Shu-zhen2FENG Cui-lian2
（1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of CATAS，Sugarcane Research Center，Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops of Ministry of Agriculture，Haikou 571101；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）

Using transgenic sugarcane leaves as materials，a small amount of young leaves were treated by alkali and transient heat，then neutralized，and cracking mixture was formed. The mixture was directly used as the template of PCR，and transgenic sugarcane exogenous gene of bar，KP4，CryIAc-2A-gna and endogenous gene Shactin as target genes，the amplified results were stable，accurate and reproducible，which reached the same effect of DNA amplification by conventional CTAB method. The templates by this method were still stable at room temperature for 2 weeks and at 4℃，-20℃ for 1 month. A series of exogenous gene PCR reactions were tested，which verified that this method was widely available in the detection of transgenic sugarcane. The method is fast for preparation of PCR templates without DNA extraction process，owing the advantages of requiring less material sample，low cost，simple，rapid，and efficient.

sugarcane；alkali lysis；neutralization；PCR template；multiple PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.012

2015-09-11

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（ITBB140502），现代农业产业技术体系建设专项基金（CARS-20-2-5）

崔学强，男，硕士研究生，研究方向：植物细胞与分子生物学；E-mail：yncuixueqiang@126.com

冯翠莲，女，博士，助理研究员，研究方向：甘蔗生物技术；E-mail：fengcuilian @126.com