响应面法优化闪式提取废弃烟叶中的茄尼醇

陶陶，陈红丽，姬小明，宋晶，云菲，贺凡，艾绿叶



响应面法优化闪式提取废弃烟叶中的茄尼醇

陶陶，陈红丽，姬小明*，宋晶，云菲，贺凡，艾绿叶

(河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002)

通过响应面法对闪式提取废弃烟叶中茄尼醇的液料比、电压和提取时间进行优化。结果表明：响应面法优化的闪式提取茄尼醇的最佳参数为液料比17∶1，电压113 V，提取时间110 s；在最优条件下进行了5次验证试验，茄尼醇的平均提取率为46.03%，与理论值(46.31%)的相对误差仅为0.6%。

废弃烟叶；茄尼醇；闪式提取技术；响应面法；Box–Behnken试验设计

茄尼醇在烟草中以自由态和结合态2种形式存在，通常占烟草总质量的0.3%~3.0%，是烟草中含量最丰富的化合物之一[1–3]，是合成心血管疾病和抗溃疡药物的中间体，经常用于合成辅酶Q10和维生素K2[4–5]。

由于茄尼醇是弱极性的不饱和聚异戊二烯醇，易溶于石油醚等极性弱的溶剂[6]，因而可以借助闪式提取组织破碎的方法[7–8]，使烟草中的茄尼醇更有效地被石油醚浸提出来。由于地理环境、种植技术等原因，全国每年都有约25%的烟叶、烟末等下脚料被废弃，不能用于卷烟生产，这不仅造成环境的污染，而且浪费了资源[9–11]。笔者以废弃烟叶为原料，采用响应面法优化闪式提取废弃烟叶中的茄尼醇，获得了闪式提取茄尼醇的最佳工艺参数，以期为实现废弃烟叶的再利用提供新方法。

1　材料与方法

1.1材料

废弃烟叶由国家烟草栽培生理生化基地提供；茄尼醇标准品(ADAMA公司产品，纯度为98%)；柱层层析硅胶(青岛海洋化工厂产品)。

主要试剂有石油醚、氯仿、95%乙醇、乙酸乙酯，均为分析纯；甲醇和乙腈为色谱纯。

主要仪器有JHBE–50S闪式提取器(河南金鼐科技发展有限公司出品)；5810R离心机(艾本德中国(北京)有限公司出品)；Waters2690高效液相色谱仪(美国Waters公司出品)；LC–30A超高效液相色谱仪(岛津(中国)有限公司出品)；质谱系统(美国AB SCIEX公司出品)。

1.2方法

1.2.1茄尼醇粗品的提取及纯化鉴定

废弃烟叶去杂、烘干后粉碎。将50 g烟样粉末加入闪式提取器中，用石油醚进行提取。提取液在8 000 r/min 条件下离心10 min，得到上清液；残渣则再次提取、分离2次。合并3次上清液，置于旋转蒸发器，35 ℃条件下减压浓缩，得到茄尼醇粗品。茄尼醇粗品进一步纯化，纯化条件参照文献[12]方法。对纯化后的茄尼醇样品进行高分辨质谱鉴定。色谱条件：岛津C18反相色谱柱(2.0 mm×75 mm，1.6 μm)；流动相为100%甲醇，等梯度洗脱；流速为400μL/min，进样量为1 μL。质谱条件：样品利用ESI正离子采集模式进行分析，质谱扫描范围为100~900；氮气作为喷雾和辅助气体；curtain gas (CUR)35psi，nebulizer gas(GS1)55psi，heater gas(GS2) 55psi；离子喷雾电压为5 500 V。离子源温度为550 °C，提高去簇电压(DP)为100 V，二级质谱采集时的碰撞能为(40±20) eV。

1.2.2废弃烟叶中茄尼醇提取率的测定

参照文献[4]，对提取及纯化后的茄尼醇样品进行含量测定，得到标准曲线= 60 792+ 435 006，求得废弃烟叶中茄尼醇总含量为1.103 2%。利用标准曲线可得从废弃烟叶中提取的茄尼醇的浓度，利用下式可得样品中茄尼醇提取率。

式中：为茄尼醇提取率(%)；为高效液相测定的茄尼醇样品质量浓度( g/mL)；为纯化后溶解茄尼醇所用溶剂的体积(此处为甲醇，2 500 mL)；为废弃烟叶样品质量(g)；0为废弃烟叶中茄尼醇总含量。

1.3试验设计

1.3.1闪式提取单因素试验

分别考察闪式提取液料比、电压、提取时间和提取次数对废弃烟叶茄尼醇提取率的影响。初始试验条件为：液料比16(mL)∶1(g)、电压110 V、提取时间100 s、提取次数1次。每优化1个因素后所得到的优化水平应用于下一因素的优化中。各水平重复3次。

1.3.2Box–Behnken试验设计

根据单因素试验结果，提取次数对茄尼醇提取率影响不显著，且提取次数增加，溶剂、时间、耗电量也随之增加，因此提取1次即可。将闪式提取的液料比、提取电压和提取时间作为试验因素，选择最大响应值及邻近水平，或拐点及邻近水平作为响应面分析的各因素的3个水平，使用Design Expert 8.0.6中的Box–Behnken方法进行试验设计(表1)。重复3次，对试验的平均结果进行响应面分析并建立模型。

表1　Box–Behnken设计因素及水平

2　结果与分析

2.1废弃烟叶中提取的茄尼醇样品的鉴定

对废弃烟叶进行闪式提取并纯化后的茄尼醇样品进行高分辨质谱鉴定。结果表明，提取的茄尼醇样品的高分辨质谱：653.562 5[M+Na]+，这与茄尼醇标准样品的高分辨质谱结果(653.562 7)吻合，并且与茄尼醇标准品的出峰时间相同。提取的样品可确定为茄尼醇。

2.2闪式提取茄尼醇的单因素试验结果

2.2.1液料比对茄尼醇提取率的影响

设定提取电压为110 V，提取时间为100 s，提取次数为1次，分别考察液料比为10∶1、13∶1、16∶1、19∶1和22∶1对茄尼醇提取率的影响。结果表明，提取率分别为32.02%、36.37%、44.14%、42.62%和41.10%，随着液料比的加大，茄尼醇提取率提高，液料比为16∶1时，提取率最高。从节约资源和提高效率方面综合考虑，液料比以13∶1~19∶1为宜。

2.2.2提取电压对茄尼醇提取率的影响

设定液料比为16∶1，提取时间为100 s，提取次数为1次，分别考察提取电压为90、100、110、120和130 V时的提取率，结果茄尼醇提取率分别为38.30%、40.33%、45.40%、38.53%和36.36%。随着提取电压的提高，茄尼醇提取率增加，当提取电压为110 V时，提取率最高，但电压继续增大，提取率则快速下降，因而选择提取电压为100~120 V较为合适。

2.2.3提取时间对茄尼醇提取率的影响

设定提取液料比为16∶1，提取电压为110 V，提取次数为1次，分别考察提取时间为60、80、100、120和140 s时的提取率，结果茄尼醇提取率分别为38.18%、39.32%、44.92%、42.35%和40.47%。随着提取时间的增加，茄尼醇提取率增加，当提取时间为100 s时，茄尼醇提取率最大，但继续延长提取时间，茄尼醇提取率下降。从减少耗电量和提高效率考虑，提取时间以80~120 s为宜。

2.2.4提取次数对茄尼醇提取率的影响

设定提取液料比为16∶1，提取电压为110 V，提取时间为100 s，分别考察提取1次、2次、3次的茄尼醇提取率，结果提取率分别为45.94%、46.15%、46.58%。随着提取次数的增加，茄尼醇提取率略有增加，但提取所用的溶剂、时间、耗电量等均增加，综合考虑，选择提取1次为宜。

2.3Box–Behnken试验结果

采用3因素3水平，以茄尼醇提取率作为响应值，进行了17组试验，结果列于表2。

表2　茄尼醇提取优化的试验结果及预测值

2.3.1响应面模型方程的建立及显著性检验

利用Design Expert 8.0.6软件，对表2中茄尼醇提取率进行多元回归拟合，获得茄尼醇提取率对液料比(1)、提取电压(2)和提取时间(3)的二次多元回归方程：=44.54+3.271+1.972+3.793－ 2.0012－1.9413+1.5323－2.5912－3.1722－3.7632。

对回归模型进行方差分析，结果见表3。

表3　回归模型的方差分析

由表3可知，23项对茄尼醇提取率的影响达到显著水平，其余各项对提取率的影响均表现为极显著。该模型=51.92，＜0.000 1，表明模型极显著；失拟项=0.14，=0.929 9，表明模型失拟不显著。经计算，模型的决定系数2=0.985 2，说明该模型与实际拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著[13]；模型的调整决定系数2=0.966 3，说明响应值的变化有96.63%来源于所选变量，即液料比、提取电压和提取时间，因此，该方程模拟实际3因素3水平是可行的，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。影响茄尼醇提取率的因素大小依次为提取时间、液料比、提取电压。

2.3.2响应面模型交互作用分析与优化

由方差分析可知，液料比与提取电压、液料比与提取时间以及提取电压与时间的交互作用对茄尼醇提取率有显著影响，用Design–Expert 8.0.6软件绘制各因素间的响应面图及其等高线图(图1~图3)，由该组动态图可以直观地看出响应面的最高点，评价试验因子交互作用对响应值的影响，以及确定各个因素的最佳水平范围[14]。

图1所示提取时间为100 s时，液料比和电压的交互作用对茄尼醇提取率的影响效果。从图1中可以看出，提取电压较大(115~106 V)，液料比较大(16∶1~19∶1)时，响应值达到最高点，液料比对提取率的影响大于电压的影响。

图1　液料比与电压交互对茄尼醇提取率影响的响应面及等高线图

图2所示为提取电压为110 V时，液料比和提取时间的交互作用对茄尼醇提取率的影响效果。从图1中可以看出，液料比较大(15.5∶1~19∶1)，提取时间较长(96~118 s)时，响应值达到最高点；提取时间比液料比对茄尼醇提取率的影响大。

图2　液料比和提取时间交互对茄尼醇提取率影响的响应面及等高线图

图3所示为液料比16∶1时，提取时间和电压的交互作用对茄尼醇提取率的影响效果。从图中可以看出，提取时间较长(112~120 s)，提取电压较大(108~120 V)时，响应值达到最大；提取时间比电压对茄尼醇提取率的影响大。

图3　提取时间和电压交互对茄尼醇提取率影响的响应面及等高线图

综合看来，提取时间对茄尼醇提取率影响最显著，在选定的时间范围内，随着时间的增加，提取率不断提高，相应曲面较陡，液料比和提取电压对提取率影响次之，响应曲面较缓。

2.5验证试验结果

通过模型预测，得到茄尼醇的最佳提取参数为：液料比16.97∶1，电压113.26 V，提取时间109.71 s。考虑实际操作的可行性，将参数修正为：液料比17∶1，电压113 V，提取时间110 s。在优化的参数下，茄尼醇理论提取率为46.31%。

为检验响应面法优化结果的可靠性，在修正后的条件下，进行了5次茄尼醇提取的验证试验，结果提取率分别为45.88%、46.12%、46.37%、45.65%和46.03%。实际测得的平均提取率为46.03%，与理论值的相对误差仅为0.6%。

3　结论

通过单因素试验考察了液料比、提取电压、提取时间和提取次数对废弃烟叶中茄尼醇提取率的影响；确定在提取1次的条件下，采用响应面法优化闪式提取条件(液料比、提取电压、提取时间)。利用响应面法建立了以茄尼醇提取率为响应值的二次模型，模型方差显著，失拟项不显著，决定系数高(2=0.985 2)。得到废弃烟叶中茄尼醇的最佳提取参数为：液料比17∶1，电压113 V，提取时间110 s。在优化的参数条件下进行验证试验，结果与理论值的相对误差为0.6%。笔者认为提取的茄尼醇若用于合成辅酶Q10和维生素K2还需进一步纯化。

参考文献：

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Response surface optimization of flash extraction for solanesol from tobacco residue

Tao Tao, Chen Hongli, Ji Xiaoming*, Song Jing, Yun Fei, He Fan, Ai Lüye

(College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Response surface methodology (RSM) was used to optimize liquid-solid ratio, motor voltage and extraction time of flash extraction. The results showed that the optimum extraction parameters of RSM were as follows: liquid-solid ratio being 17∶1, motor voltage 113 V, and extraction time 110 s. Verification experiments of solanesol extraction were carried out for 5 times under the optimal extraction conditions, and the yield of solanesol was 46.03%, presenting a relative error 0.6% with theoretical datum (46.31%).

tobacco residue; solanesol; flash extract technology; response surface methodology; Box–Behnken experimental design

TQ464

A

1007-1032(2016)05-0484-05

2016–05–17

2016–06–28

河南省科学技术厅重点科技攻关项目(1512102210059)；河南省高等学校重点科研项目(15A550017)

陶陶(1990—)，女，河南信阳人，硕士研究生，主要从事烟草化学研究，tao2018tao@163.com；*通信作者，姬小明，博士，教授，主要从事烟草化学研究，jxm0371@163.com

投稿网址：http://xb.ijournal.cn

责任编辑：罗慧敏

英文编辑：罗维