m iR-342-3p抑制SM 22α启动子的转录活性

尚　丹　李美红　许　馨　曹山虎　孙绍光1.北京铁路局石家庄卫生防疫站，河北石家庄050000；2.山东省招远市人民医：药剂科，山东招远265400；.河北医科大学基础医学：生物化学与分子生物学教研室，河北石家庄050017

m iR-342-3p抑制SM 22α启动子的转录活性

尚丹1*李美红2*许馨3曹山虎3孙绍光3
1.北京铁路局石家庄卫生防疫站，河北石家庄050000；2.山东省招远市人民医：药剂科，山东招远265400；3.河北医科大学基础医学：生物化学与分子生物学教研室，河北石家庄050017

目的探究miR-342-3p是否通过作用于SM22α启动子，从转录水平调控SM22α的表达。方法通过软件RNAhybrid分析发现，大鼠SM22α启动子中存在一个miR-342-3p的识别位点。将miR-342-3pmimics与报告基因载体pGL3-SM22α-Promoter共转染293A细胞，通过检测荧光素酶活性来分析miR-342-3p对SM22α启动子转录活性的影响。将miR-342-3p mimics转染血管平滑肌细胞，采用qRT-PCR和Western blot分别检测SM22α mRNA和蛋白质水平，分析miR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM22α表达的影响。结果与miR-control相比，miR-342-3p能够使SM22α启动子转录活性降低（0.54±0.03）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；与miR-control相比，miR-342-3p能够使血管平滑肌细胞中SM22αmRNA水平降低（0.45±0.04）倍，SM22α蛋白质水平下降（0.41± 0.05）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论miR-342-3p通过抑制SM22α启动子活性，从转录水平降低SM22α的表达，为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化研究提供了新角度。

microRNA；miR-342-3p；SM 22α；启动子

［Avsteact］Ov jective To explore whethermiR-342-3p could repress the expression of SM22αat the transcriptional level by targeting its promoter.M ethods Therewas a potential binding site ofmiR-342-3p in the SM22αpromoter analyzed by using RNAhybrid software.293A cells were co-transfected with miR-342-3p mimics and pGL3-SM22α-Promoter reporter gene vectors，luciferase activity was detected to analyze whether the SM22αpromoter activity is repressed bymiR-342-3p.Vascular smoothmuscle cellswere transfected withmiR-342-3p mimics，SM22αmRNA and protein levelswere detected by using qRT-PCR and Western blot，to explore the influence ofmiR-342-3p on the expression of SM22αin vascular smooth muscle cells.Results Compared with miR-control，SM22αpromoter transcriptional activity was reduced（0.54±0.03）folds bymiR-342-3p，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The SM22αmRNA in vascular smooth muscle cellswas decreased（0.45±0.04）folds，and the SM22αprotein levelwas decreased（0.41±0.05）folds bymiR-342-3p，compared withmiR-control，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.Conclusion miR-342-3p represses the expression of SM22αat the transcriptional level by targeting its promoter，which provides a novel perspective for the study ofmiRNA in vascular smooth muscle cell phenotypic switch regulation.

［Key woeds］microRNA；miR-342-3p；SM22α；Promoter

microRNA（miRNA）是一类内源性的、长约22个核苷酸的调控性非编码RNA。miRNA的主要作用模式是通过碱基不完全互补配对的方式介导RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）与胞质中靶mRNA的3'UTR结合，从转录后水平抑制靶基因的翻译［1］。值得关注的是，成熟miRNA不但分布在细胞质中，还广泛分布在细胞核内，并且很多miRNA在核内的浓度远高于在胞质中的浓度［2-3］。研究证实，胞核中的miRNA通过与基因启动子结合，从转录水平调控靶基因的表达。例如，miR-320通过与POLR3D基因启动子结合，抑制其转录［4］；miR-373与E-cadherin启动子结合在转录水平诱导基因的表达［5］；miR-744和miR-1184均可与cyclin B1启动子结合并诱导其转录上调，参与肿瘤的发生［6］；miR-130a与水通道蛋白AQS4 M1基因启动子结合抑制其转录水平，参与调控细胞液体平衡［7］。

目前，关于miRNA能否从转水水平参与调控血管平滑肌细胞表型转化完全未知。SM22α（smooth muscle 22）是一种重要的分化型血管平滑肌细胞的表型标志物，参与调控血管平滑肌细胞的增殖和表型转化，在动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病中发挥重要作用［8-9］。本研究发现，大鼠SM22α启动子中存在一个miR-342-3p识别位点，经报告基因分析等实验证明，miR-342-3p能够抑制SM22α启动子转录活性，从转录水平下调SM22α的表达，进而可能参与调控血管平滑肌细胞表型转化。本研究为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化的机制研究提供了新角度。

员资料与方法

1.1主要仪器与试剂

实时定量PCR仪型号为ABI7300，凝胶成像仪为Li-COR公司Odyssey红外荧光扫描成像系统，管式冷光仪为Berthold Technologies公司Flash&Glow LB955。质粒提取纯化试剂盒、质粒pGL3和pRL-TK、双荧光素酶报告基因测试试剂盒购自Promega公司；脂质体Lipofectamine 3000、Trizol、逆转录和实时定量PCR检测试剂盒等购自Life Science公司；miRNA mimics购自上海吉玛制药技术有限公司；抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；大鼠血管平滑肌细胞株（A7R5）和293A细胞购自美国ATCC公司；胎牛血清和高糖DMEM培养基购自Gibco公司；重组质粒pGL3-SM22α-Promoter［10］为河北医科大学：生物化学与分子生物学教研室构建保存。

1.2细胞培养

大鼠血管平滑肌细胞株（A7R5）和293A均使用含有10%胎牛血清和双抗的高糖DMEM，在37℃、5% CO2培养箱中进行培养。

1.3miRNA的转染

将A7R5细胞接种到T25细胞培养瓶，细胞密度达到80%时进行转染。用脂质体Lipofectamine 3000转染试剂，每瓶加入15μL脂质体溶于100μL无血清无抗生素DMEM培养液中，混匀，室温静置5min。每瓶加入40 nmol/LmiRNA溶于100μL无血清无抗生素高糖DMEM培养液中，混匀，室温静置5 min。将上述脂质体和核酸轻轻混匀，室温静置20min。每瓶换新鲜的无血清无抗生素DMEM培养液1.8 mL，将混合液加入，混匀后置培养箱中，37℃培养。转染后6 h，更换为常规高糖DMEM培养液。培养48 h后收细胞，进行RNA或蛋白质提取。

1.4293A细胞转染与报告基因分析

将293A细胞接种到24孔板，细胞密度达到80%时进行转染。每孔加入5μL脂质体Lipofectamine 3000、400 ng质粒pGL3-SM22α-Promter、50 ng内参质粒pRL-TK和20 nmol/LmiRNA，其他操作与上述A7R5细胞的转染相同。培养24 h后，按Dual-Luciferase报告基因检测试剂盒进行荧光素酶活性测定。

1.5RNA提取、逆转录与实时定量PCR

采用Trizol一步法提取RNA。逆转录和实时定量PCR操作均按照试剂盒说明进行。使用的PCR引物序列为SM22α上游引物：5＇-CGAGGAAGGAGCACGAAG-3＇，SM22α下游引物：5＇-TCCTGCGTTGCTGTCTGT-3＇，β-actin上游引物：5＇-TGTGCCCATCTATGAGGGTTACG-3＇，β-actin下游引物：5＇-AAGAGGATGCGGCAGTGGC-3＇。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸15 s，重复40个循环；然后进行溶解曲线分析。采用相对定量方法（2-△△Ct）对实时定量PCR的结果进行分析。

1.6W estern blot检测蛋白表达

采用RIPA细胞裂解液提取细胞蛋白，用改良的Lowry法进行蛋白定量。采用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，每个泳道加入30μg蛋白样本。采用半干转膜法。使用含5%脱脂奶粉的TTBS于37℃封闭PVDF膜2 h。将膜置入TTBS适当稀释的一抗溶液中，4℃孵育过夜。TTBS室温洗膜3次，每次10min。将膜置入1∶2000稀释的荧光标记二抗溶液中，于室温避光孵育1 h。避光洗膜后，使用Odyssey红外荧光成像系统扫描成像。

1.7统计学方法

上述实验均重复3次，取其均值。采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠SM 22α启动子与m iR-342-3p的结合位点

采用RNAhybrid［11］软件分析发现，大鼠SM22α启动子（-103～-122）含有一个miR-342-3p识别位点；通过Targetscan［12］软件分析大鼠SM22α3'UTR上未发现miR-342-3p的识别位点。见图1。

2.2m iR-342-3p对大鼠SM 22α启动子转录活性的影响

为了论证miR-342-3p与大鼠SM22α启动子是否存在直接相互作用，本研究将miR-342-3p mimics、miR-control分别与pGL3-SM22α-Promoter和pRLTK质粒共转染293A细胞，通过荧光素酶活性分析显示，与miR-control相比，miR-342-3p能够使SM22α启动子转录活性降低（0.54±0.03）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。细胞表型标志基因α-SMA蛋白质水平下降了（0.28± 0.04）倍，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3B。

图1　大鼠SM 22琢启动子与m iR-342-3p的结合位点

图2　m iR-342-3p对大鼠SM 22琢启动子转录活性的影响（n=3）

2.3m iR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM 22α mRNA和蛋白质水平的影响

为了论证miR-342-3p是否在血管平滑肌细胞中调控通过与启动子互作从转录水平调控SM22α的表达，本研究向A7R5细胞中分别转染miR-342-3p mimics、miR-control。qRT-PCR检测显示，与miR-control相比，miR-342-3p使SM22αmRNA水平降低了（0.45±0.04）倍，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3A。另外，Western blot检测显示，转染miR-342-3p血管平滑肌细胞中SM22α蛋白质水平下降了（0.41± 0.05）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；血管平滑肌

图3　m iR-342-3p对血管平滑肌细胞中SM 22琢m RNA和蛋白质水平的影响（n=3）

3　讨论

miRNA除了通过与启动子结合，从转录水平调控靶基因的表达外［4-7］，还能够通过以下调控模式参与众多生物学过程：①miRNA能够进入线粒体，与靶mRNA 5'UTR结合，激活靶基因的翻译。例如，miR-1与Ago2协同结合于线粒体中ND1和COX1 mRNA的5'UTR，增强它们的翻译效率，调控骨骼肌、心肌细胞的分化过程［13］。②miRNA能够与胞核中靶primiRNA结合，参与miRNA的加工调控。例如，miR-709可以与核内pri-miR-15a/16-1结合，抑制miR-15a/16-1的成熟，参与调控细胞凋亡［14］。③miRNA通过与靶mRNA的开放阅读框结合，从转录后水平抑制其翻译。例如，miR-134、miR-296和miR-470能够结合于Nanog、Oct4和Sox2等基因mRNA的开放阅读框，抑制蛋白表达水平，参与调控胚胎干细胞的分化［15］。④miRNA除了识别靶mRNA的3'UTR外，还能与靶mRNA的5'UTR结合，从转录后水平调控靶基因的翻译。例如，miR-10a能够结合于多种核糖体蛋白mRNA的5'UTR，增强它们的翻译效率［16］。⑤miRNA与lncRNA发生互作。例如，miR-133和miR-135可通过与linc-MD1的结合，在转录后水平调节转录因子MAML1和MEF2C的表达，参与肌肉分化调控过程［17］。⑥miRNA与假基因发生互作。例如，miR-19b和miR-20a可与PTENP1假基因3'UTR结合降低其丰度，进而调控抑癌基因PTEN活性［18］。⑦miRNA通过与蛋白因子结合在转录后水平调节基因的表达。例如，miR-328可以与蛋白质HnRNPE2结合，使其与CEBPA mRNA解离，促进细胞分化［19］。

miRNA广泛参与了VSMC表型转化、增殖、分化等生物学过程［20-25］，在动脉粥样硬化等疾病的发生发展中扮演重要角色，但这些成果主要关注miRNA对胞质中mRNA 3'UTR的转录后调控模式，而未对上述其他调控模式进行探讨。本研究发现，miR-342-3p能够降低血管平滑肌细胞中SM22αmRNA和蛋白质水平。通过分析在SM22αmRNA 3'UTR中未发现miR-342-3p的识别位点，而在大鼠SM22α启动子中存在1个miR-342-3的识别位点。由此推测miR-342-3可能通过与SM22α启动子相互作用，从转录水平，而不是转录后水平，调控SM22α的表达。为了论证上述推测，本研究通过报告基因分析，证明miR-342-3能够抑制SM22α启动子转录活性。提示miR-342-3p通过作用于SM22α启动子，从转录水平下调SM22α的表达。

总之，本研究证明miR-342-3p不通过作用于大鼠SM22αmRNA 3'UTR，而是通过作用于大鼠SM22α启动子，从转录水平下调SM22α的表达，进而可能参与血管平滑肌细胞表型转化调控，为miRNA调控血管平滑肌细胞表型转化的机制研究提供了新角度。

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m iR-342-3p eepeesses teansceiptional activity of SM 22αpeomotee

SHANG Dan LIMeihong XU Xin CAO Shanhu SUN Shaoguang

1.Shijiazhuang Health and Epidemic Prevention Station，Beijing Railway Bureau，Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；2.Department of Pharmacy，Zhaoyuan People's Hospital，Shandong Province，Zhaoyuan 265400，China；3.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Basic Medical College，Hebei Medical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China

R34

A

1674-4721（2016）08（c）-0012-051*2*333

2016-05-23本文编辑：程铭）

国家自然科学基金项目（81200215）；河北省自然科学基金资助项目（H2013206151）；河北省医学科学研究重点课题计划（1120140198）。

*共同第一作者

孙绍光（1978.4-），男，博士，副教授；研究方向：调控性非编码RNA。