淋球菌核酸检测试剂盒的质量评价

王春娥　卢　旭　石继春　刘茹凤　李　红　陈　琼　唐　静　陈翠萍　叶　强中国食品药品检定研究：卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050

淋球菌核酸检测试剂盒的质量评价

王春娥卢旭石继春刘茹凤李红陈琼唐静陈翠萍叶强
中国食品药品检定研究：卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京100050

目的对12种淋球菌核酸检测试剂盒进行质量评价。方法应用12种淋球菌PCR试剂盒质控参考品，按照各试剂盒说明书的方法提取模板及核酸扩增，检测各试剂盒的阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、批内精密度及最低检测限，并进行比较分析。结果12种试剂盒的阳性参考品符合率及阴性参考品符合率均为100%；批内精密度：各试剂盒检测结果Ct值的变异系数均小于5.0%；12种试剂盒中有10种试剂盒的最低检出限能达到1×103个菌/mL，其中3种能达到1×102个菌/mL，但另外2种试剂盒的最低检出限仅达到1×104个菌/mL。结论12种淋球菌核酸检测试剂盒质量均较好，性能可靠。

淋球菌；试剂盒；国家参考品；实时PCR

［Avsteact］Ov jective To evaluate twelve PCR kits for detection of Neisseria gonorrhea.M ethods Twelve kinds of Neisseria gonorrhoeae PCR kitwere selected，the templates extract and nucleic acid amplification of the quality control reference were conducted according to the kit introduction.The coincidence rates of positive and negative reference，the within-run precision and the lowest detection limit of the kits were detected according the national reference panel of Neisseria gonorrhea and were comparatively analyzed.Results The coincidence rates of positive reference and negative reference of all kits were 100%，and the CV of test results for precision was all less than 5.0%.The lowest detection limit of 10 kits was 1×103bacteria/mL，and 3 kits was 1×102bacteria/mL among them.But the CV of the other 2 kits was only 1×104bacteria/mL.Conclusion The twelve PCR kits for Neisseria gonorrhea are reliable.

［Key woeds］Neisseria gonorrhea；Kit；National reference panel；Real-time PCR

淋球菌常可引起人类泌尿生殖系统化脓性感染，俗称淋病。淋病是我国发病率较高的性传播疾病之一，及早发现和有效治疗是控制淋球菌感染的有效方式［1-2］。目前用于淋球菌的检测方法很多，如涂片法、培养法、免疫学检测法［3］、酶法［4］、核酸检测法等。近年来淋球菌的核酸检测以其快速、灵敏成为主流方法［5-6］，目前国内已有17家企业的淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、7家企业的淋球菌、解脲脲原体、沙眼衣原体二联或三联核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）获得国家食品药品监督管理局的批准，尚有多家企业申报注册。本实验使用淋病PCR试剂盒质控参考品，对8家企业已上市的9种试剂盒及2015～2016年3家企业在中国食品药品检定研究：（以下简称“中检：”）申报注册的淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行检测，并进行质量分析与评价。

员对象与方法

1.1淋病PCR试剂盒质控参考品

参考品由中检：呼吸道细菌疫苗室制备，包括10份阳性参考品（NG-P1～NG-P10）、10份阴性参考品（NG-N1～NG-N10）、5份精密度参考品（NG-R）和1份最低检出限参考品（NG-S），共计26份，批号：210015-201511。

1.2试剂与仪器

试剂盒A～I为已上市销售的8家企业的9种不同的淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），试剂盒J、K、L为2015～2016年在中检：申请注册检验的来自3家企业的试剂盒，其中试剂盒K为沙眼衣原体/淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。QIAamp DNA Mini Kit（NO.51304）购自QIAGEN公司；7500荧光定量PCR仪（ABI7500）为ABI公司产品；全自动医用PCR分析系统（GeneXpertDx）为Cepheid公司产品。

1.3方法

按照各试剂盒的产品说明书对参考品进行处理，提取DNA。将阳性参考品、阴性参考品处理后按照各试剂盒扩增条件分别进行PCR。将精密度参考品分10次提取核酸模板，分别经10次PCR扩增，计算批内Ct值的变异系数（CV）。将最低检出限参考品NGS进行10倍系列稀释3个稀释度，浓度分别为1× 104、1×103、1×102个菌/mL，标记为S4、S3、S2，分别提取模板进行PCR。若试剂盒中不含DNA提取试剂或者对提取试剂未作特殊说明，则采用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit提取DNA。根据各试剂盒的说明书，在荧光定量PCR仪上进行扩增。

2　结果

2.1阳性参考品符合率

采用10份淋球菌阳性参考品对12种试剂盒的18批次样品进行检测，各试剂盒的阳性参考品符合率均为100%，符合参考品的检测要求。见表1。

2.2阴性参考品符合率

采用10份淋球菌阴性参考品对12种试剂盒的18批次样品进行检测，各试剂盒的阴性参考品符合率均为100%，符合参考品的检测要求。见表1。

2.3批内精密度

采用精密度参考品对12种试剂盒的18批次样品的批内精密度分别进行检测，其目的基因检测通道Ct值为13.22～30.00，CV值为0.3%～4.6%，均低于5.0%。见表1。

表1　不同试剂盒的阳性参考品尧阴性参考品尧精密度参考品检测结果

2.4最低检出限

采用系列梯度稀释的最低检出限参考品对不同企业的试剂盒进行检测，结果发现不同试剂盒的最低检出限有所不同，12种试剂盒中有10种试剂盒的最低检出限能达到1×103个菌/mL，其中试剂盒D、J、K的最低检出限可达到1×102个菌/mL。但另外2种试剂盒（试剂盒I、L）的最低检出限仅达到1×104个菌/mL。见表2。

表2　不同试剂盒的最低检出限检测结果

3　讨论

体外诊断试剂国家标准物质对于体外诊断试剂的质量控制尤为重要，是进行质量评价的重要物质［7］，本实验采用的淋病PCR试剂盒质控参考品为中检：制备的国家参考品，用于淋球菌核酸检测试剂盒的质量控制和评价。本研究对9种市售及3种正在进行申报注册检验的淋球菌相关的核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行检测，旨在了解我国淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）的质量状况。结果显示，各试剂盒均能正确区分阳性参考品以及阴性参考品，符合率均达到100%。用精密度参考品检测不同试剂盒的批内精密度，其目的基因检测通道的Ct值为13.22～30.00，CV值为0.3%～4.6%，均在5.0%以下，说明这12种试剂盒性能较稳定，重复性好。但不同试剂盒的最低检出限存在差异，12种试剂盒中的12种试剂盒中有10种试剂盒的最低检出限能达到1×103个菌/mL，其中试剂盒D、J、K的最低检出限能够达到1× 102个菌/mL，灵敏度较高。但试剂盒I、L的最低检出限仅达到1×104个菌/mL。对于注册检验的试剂盒，通过对同一企业不同批次样品的检测结果进行比较，发现各批次样品的最低检出限均符合相应的产品技术要求，但各批次样品的精密度存在一定差异。

淋球菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）的原理是根据淋球菌特异性基因区域设计引物和探针，在提取样本DNA之后采用荧光PCR对其进行检测。11家企业的12种试剂盒均采用PCR与Taqman荧光探针相结合的技术，实时监测扩增产物，通过监测整个PCR过程荧光信号的变化，对未知模板进行定性分析。常作为淋球菌检测的靶基因有隐蔽性质粒基因（cppB）［8］、染色体基因、透明蛋白（opa）基因［9］、PorA假基因［10-11］、菌毛DNA、rRNA基因［12］等，目前国内淋球菌核酸试剂盒所采用的目的基因主要有cppB基因、opa基因、PorA假基因。cppB基因是较早应用的靶基因［13］，但由于cppB基因在一些淋球菌菌株中缺乏［14-16］，存在出现假阴性结果的风险，Bruisten等［17］认为cppB基因不宜作为淋球菌基因扩增的靶标。近年来，较多使用的靶基因为opa基因和PorA假基因。本实验所使用的试剂盒分别含有这3种靶基因。试剂盒G、I、J、K、L均设有内标对照，参与样本提取，并对整个PCR过程进行实时监控，可以有效排除假阴性结果，提高了检测的准确性。

综上所述，本实验对11家企业的12种淋球菌相关的核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行了检测，结果表明该类试剂盒的质量较好，性能可靠，为此类产品的生产、研究及质量评价提供了科学有效的依据。

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Evaluation ofquality conteol foePCR kitsin detection ofNeisseeiagonoeehea

WANGChun'e LU Xu SHIJichun LIU Rufeng LIHong CHEN Qiong TANG Jing CHEN Cuiping YEQiang

National Institutes for Food and Drug Control，Key Laboratory of Method and Standardization for Quality Control of Biotechnical Products，Ministry of Public Health，Beijing 100050，China

R515

A

1674-4721（2016）08（c）-0008-04

2016-05-10本文编辑：任念）

国家科技基础条件平台国家微生物资源平台奖补经费资助项目（NIMR 2016-2）。

王春娥（1980.10-），女，硕士，研究方向：医学微生物菌种资源的保藏及研究，细菌类疫苗及体外诊断试剂质量控制。

叶强（1964.12-），男，硕士，主任技师，中国食品药品检定研究：呼吸道细菌疫苗室主任；研究方向：医学微生物菌种资源的保藏及研究，细菌类疫苗及体外诊断试剂质量控制。