白木香叶正丁醇部分指纹图谱研究※

周海玲　马麟　易智彪

（1广州中医药大学第二附属医院药剂科，广州510120；2广州中医药大学中医药数理工程研究院，东莞523808）

白木香叶正丁醇部分指纹图谱研究※

周海玲1马麟1易智彪2*

（1广州中医药大学第二附属医院药剂科，广州510120；2广州中医药大学中医药数理工程研究院，东莞523808）

目的建立白木香叶正丁醇部位HPLC指纹图谱，并进行方法学考察，为白木香叶的质量控制提供理论依据。方法采用HPLC分析方法，色谱柱为kromasil-C18，流动相：乙腈-0.3%磷酸缓冲盐梯度洗脱，固定流速：0.8 mL/min；检测波长：340 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。结果在10份检测样品中，标示出13个共有峰，构成白木香叶指纹图谱。结论该方法准确可靠，所得指纹图谱共有模式可作为白木香叶质量控制的依据。

白木香叶；指纹图谱；中药化学

瑞香科常绿乔木白木香［Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg.］，被列为国家二级重点保护植物，是《濒危野生植物种国际公约》中的保护树种，是我国特有而珍贵的药用植物［1-4］。白木香叶为白木香的非药用部位，其相关研究还很少。本文通过采用高效液相色谱法研究不同产区白木香叶正丁醇提取部位的指纹图谱，获得其共有模式，为白木香叶的质量控制提供依据。

1　仪器与试药

1.1仪器岛津LC-20A（UV/Vis）高效液相色谱仪（日本岛津公司，包括：四元高压梯度泵，在线真空脱气机，DAD二级管阵列检测器，LCsolution Ver 1.X色谱工作站）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A（国家药典委员会）；KQ5200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S sartorius十万分之一分析天平（鹤壁市鑫泰高科仪器制造有限公司）。

分析甲醇（天津富宇精细化工有限公司，批号120902）；色谱乙腈（德国merck公司，批号：1.00003.4004）；

1.2药材白木香叶分别采集于广东省不同地区，标号为S1～S10，采集时间均为2013年6月。

表1　白木香叶药材来源

2　方法与结果

2.1对照品溶液制备精密称取芒果苷对照品12.7 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.254 mg/mL的芒果苷对照品溶液。封口胶密封后置于4℃冰箱内，避光保存。

2.2供试品的制备精密称取干燥的白木香叶粉末3 g，置于150 mL锥形瓶中，加入甲醇50 mL，超声30 min，冷却后抽滤，滤液减压浓缩至无醇味，依次用乙醚以及水饱和后的正丁醇按体积比1∶1各萃取3次，合并正丁醇萃取液，浓缩定容至25 mL，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.3色谱条件色谱柱为kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.3%磷酸缓冲盐梯度洗脱，固定流速：0.8 mL/min，柱温：25℃；检测波长：340 nm；进样量：10 μL。

表2　梯度洗脱程序（%）

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验取S1供试品溶液1份，每次进样10 μL，连续进样5次，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果显示，各共有峰相对保留时间以及相对峰面积的RSD值均小于3%，说明该系统精密度良好。

2.4.2稳定性实验取S1供试品溶液1份，分别于0、3、6、9、12 h进样测定，每次进样10 μL，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果显示，各共有峰相对保留时间以及相对峰面积的RSD值均小于3%，说明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.3重复性实验精密称取6份S1干燥白木香叶粉末各3 g，分别按2.3项操作，制备供试品溶液，每份供试品进样10 μL，计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果显示，各共有峰相对保留时间以及相对峰面积的RSD值均小于3%，说明本方法重复性良好。

2.5指纹图谱建立取不同产地的白木香叶，按2.2项下方法制备供试品溶液，各取10 μL分别进样，按2.3的色谱条件进行HPLC分析，建立指纹图谱。以芒果苷为内参比峰标示出白木香叶的HPLC指纹图谱中13个共有峰作为构成指纹图谱稳定的特征峰，同时将所得到的色谱图数据导入指纹图谱评价系统，进行色谱峰匹配，建立白木香叶指纹图谱共有模式，并计算相似度。

3　讨论

3.1洗脱程序的确定采用kromasil-C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸缓冲盐为流动相进行梯度洗脱，固定流速为0.8 mL/min，进样量10 μL。通过大量预实验反复多次对流动相比例进行调整，最终确定洗脱程序见表2。

3.2缓冲盐浓度的选择结合文献研究发现，采用磷酸缓冲盐或高浓度的甲酸缓冲盐可明显改善白木香叶中各成分的分离洗脱效果［5-7］。但由于过高的酸度容易使缓冲盐结晶析出，造成色谱柱的堵塞，从而影响实验进程以及色谱柱寿命，故本实验选用浓度为0.1%、0.3%、0.5%的磷酸缓冲盐，考察缓冲盐浓度对各成分分离效果的影响，确定最佳缓冲盐比例为0.3%。

3.3色谱柱的选择分别考察kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱、Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱、Thermo-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱对3.1所确定洗脱程序的分离效果，结果显示kromasil-C18色谱柱对目标峰分离效果较好。

3.4柱温的选择在确定上述色谱分析条件的基础上，分别在25℃、28℃、30℃柱温条件下对该洗脱程序的分离效果进行验证。结果显示25℃柱温（室温条件）已经可以达到较好的分离效果，故后续试验均选择在室温条件下进行。

3.5波长的选择以及特征峰的确定在确定上述色谱分析条件的基础上，采用DAD二级管阵列检测器对不同波长下供试品溶液HPLC图谱进行对比，根据实际情况综合考虑选定出峰数较多，并且响应值较为均衡的波长作为最佳测定波长，并在该波长下标记13个响应值较大的峰作为特征峰，并将对照品峰进行标识，最终选择340 nm波长作为测定波长。

3.6参照峰的选择芒果苷是白木香叶中的一种特征成分，其对照品在各特征峰中峰面积所占比例最大，且响应值最为稳定，故选择芒果苷峰作为本指纹图谱的参照峰。

3.7指纹图谱的建立及相似度分析按上述色谱条件分别将10批供试品进样分析，记录色谱图，并计算相对保留时间以及相对峰面积值，结果见表3及表4。

表3　10批白木香叶共有峰相对保留时间（%）

表4　10批白木香叶共有峰相对峰面积（%）

使用国家药典委员会所提供的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对各批次白木香叶正丁醇部位HPLC指纹图谱进行分析处理，得到各样品HPLC色谱图及能够反映各样品共性特征的白木香叶正丁醇部位指纹图谱，见图1。同时以生成的对照图谱为对照计算各批次样品的相似度均大于95%，说明各产地的药材有较好的一致性，具体结果见表5。

图1　白木香叶正丁醇部位指纹图谱

表5　不同批次白木香叶正丁醇部位特征指纹图谱进行相似度评价

3　结论

本研究前期通过大量的预实验对指纹图谱条件进行优化探索，最终建立了白木香叶正丁醇部位HPLC特征指纹图谱，通过对不同产地10批白木香叶药材的正丁醇部位进行特征性测定，共标记13个共有峰，各批次样品共有峰的相对保留时间RSD值都小于3%。相似度评价结果发现，各批次药材共有峰相似度均在0.95以上，表明在该色谱条件下，不同产地的10批药材之间相似度良好，完全符合中药特征性指纹图谱的技术规范。因此，本实验通过建立白木香叶正丁醇部位HPLC指纹图谱，对白木香叶正丁醇部位各化学成分进行监控，从而为后续抗炎物质基础的探讨提供谱图依据，同时也对白木香叶的质量进行了初步研究。

［1］梅全喜，李汉超，汪科元，等.南药沉香的药用历史与产地考证［J］.今日药学，2011，21（1）：3-5.

［2］梅全喜，李汉超，汪科元.南药中山沉香的产地考证与发展构想［J］.时珍国医国药，2007，18（8）：2049-2051.

［3］朱晓光.岭南本草古籍三种［M］.北京：中国医药科技出版社，1999：73.

［4］黄海波，刘心纯，楼步青.香港商品伪沉香鉴别研究［J］.广东药学，2002，12 （4）：5-7.

［5］聂春晓，宋月林，陈东，等.白木香叶化学成分的研究［J］.中国中药杂志. 2009，34（7）：858-860.

［6］冯洁，杨秀伟.白木香叶化学成分的研究［J］.中国中药杂志，2012，37（2）：230-234.

［7］冯洁，杨秀伟.白木香叶脂溶性化学成分研究［J］.中国中药杂志，2011，36 （15）：2092-2095.

古医籍中附子之区别

《本经》言附子，即今《药典》所收载之毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx的子根加工炮制品，拉丁名：Aconitilateralis Radix Praeparata.

《金匮要略》所载川乌，《本经》所言是乌头，则是《药典》所载毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的母根加工炮制品，处方用名：“川乌”，拉丁名：Aconiti Radix.

《本经》言天雄，即指现今临床应用之“天雄”，系毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDobx.的块根（既不是子根，也不是专指其母根），即不生子根的块根加工品，毒性更强，其拉丁名：AconitiSingularis Radix.其功能与附子相类。

附子温中之临床解读

《本经》言“温中”，是指治疗中焦脾胃阳虚阴盛的方法。临床症见食不消化，呕吐清水，大便清稀，舌淡苔白，脉沉细等。“中”，即中焦脾胃等，也包含温肾，指其温的作用在内。常用方剂简介如下。

附子理中丸（《太平惠民和剂局方》方）：附子、人参、干姜、炙甘草、白术各三两，主治中焦虚寒之证。

肾气丸（《金匮要略》方）：干地黄八两，山药四两，山茱萸四两，泽泻三两，茯苓三两，牡丹皮三两，桂枝（肉桂）、附子各一两。功在“补肾助阳”，治疗肾阳不足证。

——摘自祝之友《解读神农本草经》

Study on Fingerprint of Butanol Extracts of Leaves of Aquilaria Sinensis（Lour）Gilg

ZHOU Hailing1，MA Lin1，YI Zhibiao2*
（1.Department of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicin，Guangzhou 510120，China；2.Institute of Mathematical Science and engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Dongguan 523808，China）

Objective To develop an HPLC fingerprint in the leaves of Aquilaria sinensis and carry out methodology investigation，and to provide a theoretical basis for the quality control of the leaves of Aquilaria sinensis.Methods By HPLC analysis method，it was carried out on a kromasil-C18 column with an isocratic elution at a flow rate of 0.8mL/min.The mobile phase was composed of acetonitrile and 0.3%H3PO4.The delection wavelength was 340 nm.The column temperature was 25℃.The sample volume was 10μL.Results In 10 samples，13 peaks existed，which composed of fingerprint of leaves of Aquilaria sinensis.Conclusion This method is accurate and reliable.The common pattern of the fingerprint can be used as the basis for quality control of Aquilaria sinensis.

leaves of Aquilaria sinensis（Lour）Gilg；fingerprint；chemistry of Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.18.058

1672-2779（2016）-18-0130-03

（本文编辑：李海燕本文校对：龚又明2016-06-14）

广东省中医药管理局科研课题（No：20142074）；广东省高新区发展专项（No：2012B011000050）

zhibiaoyi@163.com