过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草杆菌芽胞的杀灭效果评价

张　黎，郑明学，郑龙龙，白　瑞，戴浩楠，史晨婕，贡　鑫，席　柔，苏晓晴，张李琦，韩克光，徐之勇，杨莎莎

(山西农业大学动物科学技术学院，山西太谷 030801)



过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草杆菌芽胞的杀灭效果评价

张黎，郑明学*，郑龙龙，白瑞，戴浩楠，史晨婕，贡鑫，席柔，苏晓晴，张李琦，韩克光，徐之勇，杨莎莎

(山西农业大学动物科学技术学院，山西太谷 030801)

为评价过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭效果，进行悬液定性和悬液定量杀灭试验。结果表明，该消毒剂对枯草杆菌黑色变种芽胞的最低有效杀灭浓度为1∶256，最短有效杀灭时间为5 min，在该浓度下作用45 min或浓度1∶64作用7.5 min均可100% 杀灭枯草杆菌芽胞。研究结果表明，该消毒剂对枯草杆菌黑色变种芽胞有较强的杀灭作用，为其进入临床应用提供了基础数据。

过氧乙酸戊二醛复方消毒剂；枯草芽胞杆菌黑色变种；芽胞；杀灭效果

近年来，人们对消毒剂的应用不断重视，并获得了良好的效果[1-2]。过氧化物类消毒剂如过氧乙酸、过氧化氢和臭氧等多用于畜禽栏舍、用具、地面及墙壁等消毒，虽然有很强的杀菌能力、无残留毒性，但是稳定性差、有腐蚀性。因此，研究了一种新的消毒剂，期望能够在临床试验中获得良好的效果。

山西农业大学动物病理学实验室依据过氧乙酸、过氧化氢和戊二醛等常用消毒剂的理化性质及其之间的协同消毒作用[3-4]，研制出了对禽流感病毒有特效作用的消毒剂，且该消毒剂可有效杀灭鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒和猪瘟病毒等消毒效果指示菌(毒)种[5-6]，但对能否有效杀灭细菌芽胞尚不清楚。

枯草芽胞杆菌黑色变种是芽胞杆菌科芽胞杆菌属萎缩芽胞杆菌种的一个芽胞杆菌菌株，美国、日本和大多数欧盟国家和地区将其列入食品和医疗卫生检测标准的质量控制标准检测菌株，被广泛应用于多种消毒剂、消毒仪器和方法的消毒效果评价中。在恶劣环境下，该菌能够产生有很强抗逆性的芽胞，该芽胞含水量低，有厚而致密的芽胞壁，并含有丰富的耐热酶，可适应各种不良环境，成为自然界中抗性最强的微生物。因此，研究过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草芽胞杆菌黑色变种的杀灭效果，为本消毒剂的临床推广应用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用菌株枯草芽胞杆菌黑色变种(ATCC9372)，购自青岛日水生物技术有限公司，由山西农业大学动物病理学实验室保存。

1.1.2试剂营养琼脂，杭州微生物试剂有限公司产品；BSA，Sigma产品产品；PBS、过氧乙酸戊二醛复方消毒剂、中和剂，均由山西农业大学动物病理学实验室提供。

1.1.2主要仪器设备0.22 μm滤器，分析天平，-80℃冰箱，pH仪，移液器，超净工作台，高压锅，恒温水浴锅，恒温培养箱，双重纯水蒸馏器等，均由山西农业大学动物病理学实验室提供。

1.2方法

1.2.1过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞定性灭菌试验过氧乙酸戊二醛复方消毒剂(专利号：101743971A)由过氧乙酸、过氧化氢、戊二醛、纯化水、稳定剂和增效剂组成的混合液，本品保存时分为A液和B液，使用时按照A∶B=24∶1混合均匀即时使用。参照参考文献[7]的方法制备枯草芽胞杆菌芽胞，依据农业部规定[8]，用含10 g/L蛋白胨的0.03 mol/L磷酸盐缓冲液芽胞悬液稀释芽胞浓度为5×105CFU/mL～5×106CFU/mL；取10支10.0 mL试管，编号T1～T10，置20℃水浴，依次加入2.5 mL灭菌蒸馏水，取2.5 mL试验用消毒剂加入T1混匀，T2～T9做倍比(1∶2)稀释，T10管仅加蒸馏水作为阳性对照组。每管加入2.5 mL菌液后5、10、15、30、60 min时，分别吸取0.5 mL加入4.5 mL中和剂中摇匀，10 min后取0.5 mL加到4.5 mL营养肉汤培养基内，同时设未处理营养肉汤作为阴性对照组。

将营养肉汤培养基置37℃培养24 h，肉汤混浊说明细菌未杀灭，肉汤澄清透明，继续培养至第7天，若仍澄清透亮说明无菌生长。以无菌生长管消毒液的最低浓度为最低杀菌有效浓度，以无菌生长管的最短消毒时间为该浓度杀菌最快有效时间。

1.2.2过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞定量灭菌试验用0.03 mol/L磷酸盐缓冲液将枯草芽胞杆菌芽胞悬液稀释为5×106CFU/mL～5×107CFU/mL[9]，取过氧乙酸戊二醛复方消毒剂2.0 mL备用。

1.2.2.1最低有效杀菌浓度对枯草芽胞杆菌芽胞定量灭菌试验取11支试管，编号T111-T113、T121-T123、T131-T133、C11和C10，每管中加入0.5 mL菌悬液，0.5 mL BSA(有机干扰物)和4.0 mL相应浓度消毒剂(依据1.2.1确定的浓度)混匀，C11管内加0.5 mL菌液，0.5 mL BSA和4.0 mL标准硬水作为阳性对照组，C10管加0.5 mL PBS液、0.5 mL BSA和4.0 mL标准硬水作为阴性对照组。在20℃水浴中分别作用0.5×t(T111-T131)、t(T121-T123)和1.5×t(T131-T133)后，从每管中取0.5 mL液体与4.5 mL中和剂作用10 min，取1.0 mL混合液做营养琼脂培养基倾注培养，于37℃温箱内培养72 h后进行活菌计数，以阳性对照组菌液浓度作为菌液原有浓度计算杀菌率。

1.2.2.2过氧乙酸戊二醛复方消毒剂在最短时间可有效灭菌的最低浓度下对枯草芽胞杆菌芽胞定量灭菌试验取11支试管，编号T211-T213、T221-T223、T231-T233、C21和C20，每管中加入0.5 mL试验菌悬液，0.5 mL BSA和4.0 mL相应浓度消毒剂(依据1.2.2.1中5 min内有效灭菌的最低浓度)混匀，方法同1.2.2.1。

判断标准：消毒t时的杀菌率Pt=[(n0-nt/n0)]×100%；n0为t时细菌原有浓度；nt为消毒后活菌数；杀菌率大于99.9%时，达到消毒效能，杀菌率为100%时，达到杀菌效能。

2　结果

2.1过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞定性杀灭结果

消毒剂稀释1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍时，作用5、10、15、30、60 min；稀释1∶128和1∶256倍时，作用10 min或30 min及以上均可有效杀灭枯草芽胞杆菌芽胞；稀释1∶512时60 min内不能杀灭枯草芽胞杆菌芽胞。本试验结果显示，该消毒剂杀灭枯草芽胞杆菌芽胞的最低有效浓度为1∶256，在此浓度下需最短作用30 min；最短作用时间为5 min，此时的最低浓度为1∶64(表1)。

表1　消毒剂定性杀灭枯草芽胞杆菌芽胞肉汤浑浊度

注：培养基浑浊，即为阳性，以“+”表示；培养基清亮，即为阴性，以“-”表示。

Note：The medium turbidity is positive,expressed as “+”; medium clear is negative,expressed as “-”.

2.2过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞定量杀灭结果

如表2和表3，相同浓度的该消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞的杀灭率随作用时间延长而增高，1∶256倍稀释时作用30 min，杀菌率为99.93%，作用45 min，杀菌率为100%；1∶64倍稀释时作用5.0 min，杀菌率为99.94%，作用7.5 min，杀菌率为100%。

3　讨论

本试验中采用的过氧乙酸戊二醛复方消毒剂杀灭枯草芽胞杆菌芽胞的最低有效浓度为1∶256，在此浓度下作用45 min，杀菌率可达100%；该消毒剂最快杀灭枯草芽胞杆菌芽胞时间为5 min，此时浓度不低于1∶64。本试验所用中和剂可有效中和完成消毒作用的消毒剂，所采用的标准硬水、芽胞稀释液及培养基等亦未被污染，不影响消毒效果的检测。试验结果表明，过氧乙酸戊二醛复方消毒剂可有效杀灭枯草杆菌芽胞。

表2　消毒剂最低有效浓度的定量杀灭结果

表3　消毒剂最短作用时间的定量杀灭结果

有研究报道[10-12]，含量为20 g/L的戊二醛消毒液对枯草杆菌(芽胞浸泡作用1 h，可将其99.99%杀灭，浸泡4 h，可将其100%杀灭。以0.5 g/L有效氯与1 g/L过氧乙酸复配得到的复方消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞悬液作用10 min，对其芽胞载体处理15 min，杀菌率方可达到100%。含量为2 000 mg/L的过氧乙酸消毒剂对枯草芽胞杆菌芽胞作用20 min，可达到合格消毒要求[13-14]。

本研究结果与上述文献报道相比，杀灭枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞所需有效成分浓度更低，用时更短，杀菌率也得到了提高，一方面降低了消毒成本[15]，另一方面可在短时间达到消毒要求，更适于生产中广泛应用。

[1]古一雯,李临生,罗琥捷.消毒剂研究新进展[J].中国消毒学杂志,2008,25(1):70-73.

[2]邱梅,郝智慧,庞云露,等.国内外兽用消毒剂的研究现状与发展趋势[J].中国兽药杂志,2011,45(6):43-47.

[3]中华人民共和国农业部.兽用消毒剂鉴定技术规范(试行)[S].北京:2008：97-103.

[4]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二部[S].北京：2010.

[5]郭亮.复方消毒剂对细胞的杀灭效果和稳定性研究[D].山西太谷：山西农业大学，2009.

[6]苏文雪.复方消毒剂对病毒的杀灭效果及急性吸入毒性研究[D].山西太谷:山西农业大学,2012.

[7]曾宏逵,谭伟龙,钱万红,等.过氧乙酸复方消毒剂杀灭枯草杆菌芽孢的实验研究[J].东南国防医药,2010,12(2):97-99.

[8]中华人民共和国农业部.兽药研究技术指导原则[S].北京.

[9]中华人民共和国卫生部.消毒技术规范[S].北京，2008.

[10]Ivan M,Josef D.Protein-tyrosine phosphorylation inBacillussubtilis:a 10-year retrospective[J].Food Control,2015,6(18):1-7.

[11]Nadine S,Helga N,Maria C,et al.Effectiveness of a peracetic acid-base disinfectant against spores ofBacilluscereusunder different environmental conditions[J].Food Control,2014,39(1):1-7.

[12]猪场消毒药物的选择以及具体消毒方案介绍[J].现代畜牧科技,2015,3(1):132.

[13]王慧，周星，苏丹，等.实验动物屏障设施常用消毒方式比较研究[J].医学动物防制,2015,31(2):225-228.

[14]高富红，李召斌，高艳艳.戊二醛苯扎溴铵溶液对鸡传染性法氏囊病病毒的杀灭效果[J].畜牧与兽医，2016,38(1)：62-63.

[15]高富红，李召斌，高艳艳.戊二醛苯扎溴铵溶液对H9N2亚型禽流感病毒的灭活效果分析[J].中国家禽，2016,38(1)：62-63.

Effect Evaluation of Acetic Acid Peroxide Glutaraldehyde Compound Disinfectant on KillingBacillussubtilisSpores

ZHANG Li,ZHENG Ming-xue,ZHENG Long-long,BAI Rui,DAI Hao-lan,SHI Chen-jie,GONG Xin,XI Rou,SU Xiao-qing,ZHANG Li-qi, HAN Ke-guang,XU Zhi-yong,YANG Sha-sha

(College of Animal Science and Technology,Shanxi Agricultural University,Taigu,Shanxi,030801,China)

In order to evaluate the germicidal effect of acetic acid peroxide disinfectant glutaraldehyde compound,the qualitative germicidal test of suspension and the quantitative bactericidal test suspension of were used toBacillussubtilisblack variant.The results showed that the minimum germicidal concentrationcon of disinfectant to killBacillussubtilisblack variant was 1∶256,and the shortest effect time to killBacillussubtiliswas 5 min.The spores ofBacillussubtilisblack variant could be completely killed at the concentration of 1∶256 in 45 min or at the concentration of 1∶64 in 7.5 min.The results suggested that the disinfectant had strong killing action toBacillussubtilisblack variant spores.It laid a theoretical foundation for the clinical application of the disinfectant.

acetic acid peroxide glutaraldehyde compound disinfectant;Bacillussubtilisblack variant;spore;germicidal effect

2016-02-29

国家科技支撑计划项目(2007BAD56B06)；山西省研究生创新基金(20143055)；山西省现代农业鸡产业技术体系项目

张黎(1990-)，女，山西吕梁人，博士研究生，主要从事动物传染病的发生与免疫机理研究。*通讯作者

S859.799.1;S852.616

A

1007-5038(2016)09-0084-03