阿里红活性部位提取物体外抑制奶牛乳房炎致病菌研究

阿得力江·吾斯曼，努尔艾力·麦提尼亚孜，布合丽倩穆·依明，阿依姑丽·买买提明，德力拜尔，赛福丁·阿不拉

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)



阿里红活性部位提取物体外抑制奶牛乳房炎致病菌研究

阿得力江·吾斯曼，努尔艾力·麦提尼亚孜，布合丽倩穆·依明，阿依姑丽·买买提明，德力拜尔，赛福丁·阿不拉*

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

为研究阿里红各活性部位对奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性。提取阿里红多糖、多酚、黄酮、生物碱及挥发油，并对各有效部位成分进行了含量测定。通过体外抑菌试验，检测各有效部位对奶牛乳房炎常见致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)及链球菌 (Streptococcus)的抑菌作用。结果表明，阿里红黄酮和生物碱对3种致病菌均具有一定的抑菌作用，且对金黄色葡萄球菌和链球菌的抑菌作用最强，可以作为抗金黄色葡萄球菌和链球菌进一步研究的材料。

阿里红；活性部位；奶牛乳房炎；抑菌试验

奶牛乳房炎给我国奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。据报道，我国平均每年因乳房炎造成的经济损失为150亿～450亿元[1]。目前，导致奶牛乳房炎的病原微生物以金黄色葡萄球菌(Staphyloco-ccusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)及链球菌 (Streptococcus)为主[2]。研究表明，天然药物具有较好的抑制奶牛乳房炎致病菌的作用。张传美等[3]检测9味中药体外抗奶牛乳房炎病原菌活性，黄芩、黄连、红花、鱼腥草水提物对葡萄球菌的抑菌作用明显，其中黄芩、鱼腥草、蒲公英和黄连对大肠埃希菌有明显的抑菌作用。杨玉艾等[4]通过体外试验，证明黄芪多糖对奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌具有广泛的抑菌作用。

阿里红Fomesofficinalis(Vill.ex Fr.)Ames为多孔菌科大型真菌药用层孔菌的干燥子实体，有“落叶松茸”之称。维吾尔医学中记载阿里红有燥湿退热，祛寒止痛，解退药毒，活血消肿等多种功效。冯薇等对阿里红生药进行鉴定，发现含多糖、三萜酸类、倍半萜类等32种化合物[5]。丛媛媛等[6]报道，阿里红多糖喂食荷瘤小鼠能显著增加小鼠抗体分泌细胞的数量，并能增强巨噬细胞的吞噬功能及血清溶菌酶的含量，提高小鼠的非特异性免疫功能。为了考察阿里红各活性部位体外抑制奶牛乳房炎致病菌的效果，本试验通过平板法和试管法，研究了阿里红各有效提取部位对奶牛乳房炎致病菌的体外抑菌效果，旨在筛选出阿里红抑菌效果较好的活性部位。

1　材料与方法

1.1材料

阿里红，购自新疆维吾尔自治区民族医院；菌株(奶牛乳房炎的主要致病菌：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌)由新疆畜牧科学院提供；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1多糖提取物的制备阿里红粉碎过60目筛，950 mL/L乙醇回流脱脂，脱脂后的阿里红水煮取上清液，收集上清液减压浓缩，通过Savage法除蛋白，加无水乙醇至800 mL/L，收集沉淀所得多糖。用苯酚硫酸法测定阿里红多糖含量[7]。用无菌水配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的水溶液备用。

1.2.2多酚提取物的制备阿里红粉碎过60目筛，500 mL/L乙醇、料液比1∶18、时间为30 min、温度为70 ℃条件下超声波浸润提取5次，收集提取液减压浓缩，乙酸乙酯萃取，干燥萃取物。用Folin-Ciocalteu法进行含量测定[8]。用无菌水配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的水溶液备用。

1.2.3黄酮提取物的制备阿里红粉碎过60目筛，700 mL/L乙醇，料液比1∶20，温度为60 ℃条件下浸润提取5次，收集提取液减压浓缩，正己烷萃取，干燥萃取物。亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法进行含量测定[9]。用二甲基亚砜配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的溶液备用。

1.2.4生物碱提取物的制备阿里红粉碎过60目筛，20 mL/L硫酸，料液比1∶0，温度为60 ℃条件下浸润提取5次，收集提取液Na2CO3调节pH，减压浓缩，乙酸乙酯萃取，干燥萃取物。碘化铋钾显色法进行含量测定[7]。用二甲基亚砜配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的溶液备用。

1.2.5挥发油提取物的制备采用CO2超临界萃取仪，于25 MPa、50 ℃、20 L/h流速下，萃取1 h，得黄色油状物，干燥提取物。香草醛硫酸显色法进行含量测定[7]。用20 mL/L的吐温-80配置成25.0、12.5、6.25 mg/mL的溶液备用。

1.2.6平板打孔法测定抑菌效果每板分别加入50 μL供试菌，同灭菌处理过的培养基一起倒板，摇匀。用直径为7 mm的打孔器均匀打孔。将各有效部位加入孔中，每个浓度重复3次，以无菌水、20 mL/L吐温-80及二甲基亚砜为空白对照组，以庆大霉素、环丙沙星为阳性对照组。恒温培养箱中37 ℃条件下，培养18 h后测量抑菌圈直径大小。

1.2.7最低抑菌浓度(MIC)的测定通过打孔法筛选出抑菌作用较强的有效部位，进行MIC的测定。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和链球菌分别置于10只试管中，第11只试管不含药物为菌液对照，第12只试管不含菌液和药液为培养基对照组，每支试管加1 mL培养基，药物以100 mg/mL为起始浓度倍比稀释10个浓度，后每管加20 μL菌液。恒温培养箱中37 ℃条件下培养18 h～24 h，观察无浑浊变化的最高药物稀释浓度作为最低抑菌浓度。

1.2.8最低杀菌浓度(MBC)的测定从最低抑菌浓度试验，未见细菌生长的透明试管中分别取培养物20 μL,接种至营养琼脂平板中恒温培养箱中37 ℃条件下培养18 h～24 h，平板中菌落数小于3个即判定为无细菌生长，以无细菌生长的药物最高稀释浓度作为最低杀菌浓度。

2　结果

2.1阿里红提取物的含量测定

提取到阿里红多糖、多酚、黄酮、生物碱及挥发油，根据回归方程计算得各有效部位含量分别为阿里红多糖61.8%、阿里红多酚25.7%、阿里红黄酮26.2%、阿里红生物碱25.4%及阿里红挥发油60.4%。

2.2阿里红有效部位的抑制效果

检测阿里红不同提取部位对奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性，如表1所示，阿里红多酚对金黄色葡萄球菌和链球菌有一定的抑菌作用，阿里红黄酮和生物碱对3种致病菌均显现出了较强的抑菌作用，阿里红挥发油对链球菌有一定的抑菌作用。随着药物浓度的增加，抑菌圈直径有不同程度的增加。挥发油除外，各有效部位对3种致病菌的抑菌强弱大小为金黄色葡萄球菌>链球菌>大肠埃希菌。

表1　阿里红有效提取部位的抑菌结果

续表1

有效部位Activeingredient浓度/(mg·mL-1)Concent抑菌圈直径/mmAntibacterialcirclediameter金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus大肠埃希菌Escherichiacoli链球菌Streptococcus25.0--11.93±0.45g挥发油Volatileoil12.5--9.53±0.45i6.25---环丙沙星Ciprofloxacin25.53±0.60a25.57±0.86a19.50±0.30b无菌水Sterilewater---吐温80Tween80---二甲基亚砜Dimethylsulfoxide---

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3阿里红有效部位的MIC试验

阿里红多酚对3种菌的MIC分别为3.13、6.25、3.13 mg/mL，说明对3种细菌均具有一定的抑菌作用。阿里红黄酮和生物碱对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌的MIC均为0.78、1.56、0.78 mg/mL，说明阿里红黄酮和生物碱对3种细菌有较强的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。挥发油对链球菌的MIC为12.5 mg/mL，对链球菌未表现出较强的抑菌作用。

表2　4种有效提取部位的MIC测定

2.4阿里红有效提取部位的MBC试验

阿里红多酚对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌的MBC分别为6.25、12.5、6.25 mg/mL，说明对3种细菌均具有一定的杀菌作用。阿里红黄酮对3种菌的MBC为0.78、1.56、1.56 mg/mL，生物碱对3种菌的MBC为0.78、3.13、1.56 mg/mL，说明这2种成分对3种细菌均具有较强的的杀菌作用，其中对金黄色葡萄球菌的杀菌作用尤为明显。挥发油对链球菌的MBC为12.5 mg/mL，对链球菌未表现出较强的杀菌作用。

表3　4种有效提取部位的MBC测定

3　讨论

为筛选出阿里红有效部位中对奶牛乳房炎常见致病菌的抑菌活性最强成分，提取阿里红各有效部位，并检测其体外抑制奶牛乳房炎致病菌的抑菌作用。天然药物有效部位对奶牛乳房炎致病菌具有较好的抑菌作用，张代玉等[10]提取苦参生物碱，研究其抗奶牛乳房炎致病菌的活性，结果表明，苦参生物碱对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和无乳链球菌均有良好的抑菌和杀菌效果。Ananda B S等[11]研究植物源抗菌剂，桂皮醛、丁香油酚、香芹酚、麝香草酚对奶牛乳房炎常见致病菌，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及链球菌的抑菌作用，4种多酚对上述细菌均有抑菌作用，其中桂皮醛抑菌作用最佳，且抑菌持续时间最长。Meignanalakshmi S等[12]提取鸭嘴花叶水提物及甲醇提取物，作用于奶牛乳房炎致病菌，其中甲醇提取物抗菌作用明显。甲醇提取物浓度为200 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌的抑菌圈大小分别为21.7 mm±0.58 mm，18.3 mm±0.58 mm和28.3 mm±0.58 mm。

本次试验通过提取阿里红各有效部位，体外试验检测其抗奶牛乳房炎致病菌的抑菌活性，从中筛选出了具有显著抑菌作用的有效部位。打孔法检测阿里红不同有效部位的抑菌作用，且与兽医临床治疗奶牛乳房炎常用药物环丙沙星进行比较。结果表明，阿里红多酚对金黄色葡萄球菌和链球菌有一定的抑菌和杀菌作用，而挥发油只对链球菌表现出了抑菌作用。阿里红黄酮和生物碱对3种致病菌均具有一定的抑菌和杀菌作用，对金黄色葡萄球菌和链球菌的抑菌和杀菌作用强于对大肠埃希菌的抑菌作用。与环丙沙星相比，25.0 mg/mL浓度时的黄酮对链球菌的抑菌作用显著高于环丙沙星，25.0 mg/mL浓度时的生物碱抑菌作用与环丙沙星无显著差异。浓度为25.0 mg/mL时的黄酮对金黄色葡萄球菌的的抑菌作用与环丙沙星的抑菌作用相接近。而各有效部位对大肠埃希菌的抑菌作用均低于环丙沙星的抑菌作用。综上所述，阿里红黄酮和生物碱对奶牛乳房炎致病菌的抑制作用最强，可作为抗金黄色葡萄球菌和链球菌进一步研究的材料。

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Inhibition Effects of Active parts of Fomes officinalis on Pathogenic Bacteria of Cow MastitisinVitro

ADELIJIANG Wusiman， NUERAILI Maitiniyazi， BUHELIQIANMU Yiming，AYIGULI Maimaitiming DELIBAIER， SAIFUDING Abula

(College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Xinjiang，Urumqi，830052， China)

In order to research on different active components fromFomesofficinalisagainst pathogenic bacteria of cow mastitisinvitro,total polysaccharides,polyphenols,flavonoids,alkaloids and volatile oil were extracted and their contents were measured.According to the main pathogens of cow mastitis (Staphylococcusaureus,EscherichiacoliandStreptococcus),we determined the inhibition effects of active components ofFomesofficinalisinvitro.The results indicated that flavonoids and alkaloids ofFomesofficinalishad obvious effects on the all kinds of pathogens of cow mastitis.Flavonoids and alkaloids possessed better activity toStaphylococcusaureusandStreptococcusin three pathogens and would be as the materials for further research.

Fomesofficinalis；active part；cow mastitis；bacteriostatic test

2016-04-07

新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJGRI2015097)

阿得力江·吾斯曼(1990-)，男(维吾尔族)，新疆伊宁人，主要从事中药药理学研究。*通讯作者

S853.73

A

1007-5038(2016)09-0063-04