陕西榆林某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

周　铭，岳进华，刘鹤媛，高　洋，李雯丽，杨启明，陈德坤

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)



陕西榆林某羊场羊口疮病毒的分离鉴定

周铭，岳进华，刘鹤媛，高洋，李雯丽，杨启明，陈德坤*

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

为获得陕西榆林地区羊口疮病毒野毒株，以榆林地区某羊场疑似羊口疮(Orf)的山羊口唇部结痂为材料，将结痂研磨悬液接种于犊牛睾丸原代细胞进行传代培养，通过特征性细胞病变(CPE)观察、PCR检测、动物回归试验等对分离的毒株进行鉴定。结果表明，经研磨的病料悬液接种于犊牛睾丸原代细胞后，盲传至第4代时产生细胞病变，测得病毒滴度为107.66TCID50/mL。对分离毒株的B2L基因克隆测序、同源性对比分析结果显示，该毒株与与国内报道的多株羊口疮毒株核苷酸序列均具有较高的同源性，其中与甘肃株( KC485343.1)福建株( KC568399.1)的同源性均达到99%。用纯化病毒液划痕接种2月龄羔羊后，在其唇部和腹股沟内侧出现丘疹和脓疱等ORFV感染的典型的羊口疮症状。表明成功获得了羊口疮病毒陕西榆林株。

羊口疮病毒；分离鉴定；聚合酶链反应；动物回归试验

羊口疮 (Orf )又称接触传染性脓疱病(Contagious ecthyma)，是由羊口疮病毒(Orf virus)引起的一种接触性传染病，以在山羊和绵羊的鼻、口唇、舌、乳房等部位形成红色丘疹、水疱、脓疱为主要发病特征[1]。该病对羔羊危害最为严重，在舍饲高密度饲养条件下通常导致群体性感染，羔羊病死率较高[2]。羊口疮在世界各地均有发生，很多国家和地区均有过报道[3]。近年来，我国陕北地区羊口疮频频发生，在陕西榆林地区某山羊养殖场调查发现，正常羊群羊口疮检出率高达70%，其中1月龄左右羔羊发病率达90%，给当地养殖户造成了严重经济损失。为此，本研究从榆林横山县某羊场采集疑似羊口疮病例山羊唇部结痂，对病料样品进行羊口疮病毒的分离鉴定，以期为羊口疮的临床诊断和安全高效的疫苗研制提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料采自陕西榆林横山县某白绒山羊养殖场中3月龄～5月龄的发病山羊，对具有典型羊口疮临床症状的发病山羊的唇部结痂进行采集。

1.1.2试验用动物1月龄健康羔羊，来自陕西千阳县奶山羊种羊场。

1.1.3细胞株和菌株本实验室制备保存的犊牛睾丸原代细胞；DH5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.4主要试剂胎牛血清、M199培养液，Gibco公司产品；胰酶、二甲基亚砜，Amresco公司产品；PCR反应相关试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品；T4 DNA 连接酶、pEGM-T 载体、DH-5α感受态细胞，北京全式金生物技术有限公司产品；质粒DNA小量制备试剂盒和SanPrep柱式 DNA 凝胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2方法

1.2.1病料采集与处理采集有典型羊口疮临床症状山羊唇部的结痂块，置于15 mL离心管中，按结痂质量与PBS体积比1∶2加入PBS(含10 mg/mL青霉素、链霉素)，于4℃放置过夜使结痂松软，充分研磨后，2 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，无菌收集滤液，置-20℃保存备用。

1.2.2羊口疮病毒分离待培养的犊牛睾丸原代细胞长满细胞瓶底约70%～80%时，弃去细胞瓶内培养液，接种600 μL处理好的病毒液，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中1.5 h后，弃去瓶内液体，加入维持液(含50 mL/L犊牛血清的M199培养基)，置于37℃培养箱中培养，72 h后收集病毒培养物，反复冻融3次，为第1代无菌收集细胞培养物。取600 μL第1代无菌收集细胞培养物接种犊牛睾丸细胞，按照第1代细胞培养物制备方法，制备第2代无菌细胞培养物。依此方法盲传至第4代时，待70%细胞发生细胞病变时，收集培养物，反复冻融3次后，收集冻融物，置-20℃保存备用。

1.2.3病理组织切片的制备采集病羊的口唇部病变皮肤并于40 g/L的多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切成5 μm厚的连续切片，HE染色检查。

1.2.4PCR鉴定采用NaI法提取能使犊牛睾丸原代细胞产生病变的细胞毒基因组DNA，选羊口疮病毒特异性基因B2L，参照登录号为JN565696.1的羊口疮病毒基因设计检测引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为dNTP Mixture 2 μL，10×buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，TaqDNA polymerase 0.25 μL，P1、P2各1 μL，提取的病毒DNA模板 1 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反应程序为：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 35 s，72℃ 30 s，共35个循环;72℃终延伸10 min。取20 μL PCR产物在20 g/L琼脂凝胶上进行电泳检测，利用DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行切胶纯化回收，将PCR纯化产物送南京金斯瑞生物有限公司测序，测序结果与GenBank上已公布的参考序列进行对比。

1.2.5病毒滴度测定在96孔板上培养犊牛睾丸原代细胞至各孔细胞密度达80%时，将病毒液连续10倍稀释分别接种于96孔板中，每孔接种100 μL，每个稀释度接种1列，11、12列为空白对照。置于细胞培养箱中培养，每天观察并记录细胞病变孔数，根据Reed-Muench氏法计算病毒TCID50值。

1.2.6动物回归试验将第5代羊口疮病毒液分别划痕接种于健康1月龄的羔羊的唇部和腹股沟，阴性对照组用生理盐水以同样的方法接种羔羊，试验组与对照组隔离饲养，每天观察发病症状。

2　结果

2.1羊口疮患病羊痂皮组织病理学观察

对临床患病羔羊嘴部痂皮组织制作石蜡切片，HE染色后，于显微镜下可观察到表皮层破溃坏死，病变皮肤复层扁平上皮细胞发生空泡变性，基层下的结缔组织中有大量炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞和大量淋巴细胞浸润(图1)。

箭头指示炎性细胞浸润

Arrow denotes infiltration of inflammatory cells

图1感染羊口疮病毒病羊唇部皮肤病理切片(HE)

Fig.1Histopathologic slices of labial skin in dairy goat infection with Orf virus(HE)

2.2分离病毒引起的细胞特征性病变

接种盲传至第4代的羊口疮病毒液72 h后，犊牛睾丸原代细胞产生明显细胞病变。病变细胞出现折光性增强、变圆、聚堆、拉网等现象(图2)，后期犊牛睾丸原代细胞发生皱缩、脱落；而正常对照的犊牛睾丸原代细胞生长状态良好，呈梭型紧密排列(图3)。

2.3分离毒株的PCR检测

用编码羊口疮病毒表面囊膜蛋白的保守基因B2L，应用PCR技术检测第5代细胞传代病毒液中的羊口疮病毒，获得了与预期片段大小相同的目的基因片段。本试验测序结果经Blast序列比对后发现，羊口疮病毒分离株的B2L基因与GenBank上公布的甘肃株、福建株等的相似度为99%，确定扩增的片段为羊口疮病毒的基因片段。

图2　接种病毒液72 h发生细胞病变的犊牛睾丸细胞Fig.2　Cattle testicular primitive cells with cytopathic effect 72 h after Orf virus inoulation at

图3　培养72 h的正常犊牛睾丸原代细胞(10×)Fig.3　Normal cattle testicular primitive cells at 71 h(10×)

M.DNA 标准DL 700;1～2.B2L基因PCR产物

M.DNA Marker DL 700;1-2. PCR products of B2L gene

图4羊口疮病毒B2L基因 PCR产物电泳图

Fig.4Electrophoresis of PCR products of Orf virus B2L gene

2.4病毒滴度测定结果

选取能引起犊牛睾丸原代细胞产生典型羊口疮病变的第5代病毒液，按10-1～10-9稀释度进行稀释，将不同稀释度的病毒液接种到犊牛睾丸原代细胞上，测定TCID50。按Reed-Muench法，测得榆林分离株第5代病毒滴度分别为107.76TCID50/mL(表1)。

表1　第5代榆林分离株TCID50的测定

2.5病毒分离株动物回归试验

将第5代羊口疮病毒榆林株划痕接种于1月龄的羔羊的唇部和腹股沟，连续观察发病情况。结果显示，在划痕接种后第4天开始产生羊口疮特征性病变，唇部出现红肿、产生脓疱，后渐渐溃破并结痂；腹股沟划痕接种部位均出现红斑、丘疹样水疱，与自然感染羊口疮的羊只发病症状一致，阴性对照组羔羊两处接种部位均自然愈合(图5)。

A.接种榆林株第5代病毒液的羔羊唇部发生羊口疮病变；B.阴性对照;C.接种榆林株第5代病毒液的羔羊腹股沟发生羊口疮病变；D.阴性对照

A.Orf lesions occurred in lips inoculated with P5 Orf virus Yulin strain;B.Negative control;C.Orf lesions occurred in inguen inoculated with P5 Orf virus Yulin strain;D.Negative control

图5接种羊口疮病毒榆林株第5代病毒液的羔羊发生羊口疮

Fig.5Orf lesions occurred in lamb challenged with P5 Orf virus Yulin strain

3　讨论

近年来，我国山羊主要养殖省份的羊口疮发病率呈不断上升趋势[4-6]。我们已从山东威海、陕西杨凌、云南泸西等地的山羊养殖场分离到了羊口疮病毒野毒株[7-8]，但在陕北地区尚未获得羊口疮野毒株。因此，有必要对该地区的羊口疮病毒株进行分离鉴定，为我国羊口疮病原学研究、流行病统计及疫苗研制奠定基础。

目前常用的羊口疮病毒鉴定方法是电子显微镜观察、PCR检测，以及用牛肾(MDBK)细胞，绵羊胚胎鼻甲(OFTu)细胞，羊、犊牛睾丸细胞等进行病毒分离培养[9-11]。但相同病料在不同的细胞上感染滴度有所不同，罗云等发现ORFV分离株在犊牛睾丸原代细胞上的感染滴度明显高于MDBK细胞，这可能与ORFV对不同细胞的增殖适应能力不同有关。B2L基因编码羊口疮病毒表面囊膜蛋白，编码大小约为42 ku的免疫原性蛋白，对B2L基因扩增的传统PCR被广泛用于ORFV的检测[3,12-13]，常用B2L基因全序列进行分子流行病学和进化分析[3,14-15]。

我们从具有典型羊口疮临床症状的发病山羊唇部采集结痂病料，用羊口疮病毒易感且感染滴度较高的犊牛睾丸原代细胞作为病毒增殖细胞，盲传至第4代时出现特征性细胞病变，病变细胞出现折光性增强、变圆、聚堆、拉网脱落现象。用编码羊口疮病毒表面囊膜蛋白的B2L基因进行PCR检测，测序结果分析显示，我们从榆林地区采集的羊口疮唇部结痂病料中检测到了ORFV特异性的B2L基因，且该分离株与GenBank上公布的其他国内外参考毒株B2L基因相应部分的核苷酸序列相似性很高，与31个羊口疮毒株核苷酸序列同源性均达到99%，说明不同地区来源的ORFV分离株的B2L基因高度保守。动物回归试验结果表明，在犊牛睾丸原代细胞上增殖的第5代细胞适应毒，能够在划痕接种3 d后引起羔羊发病，与临床上自然感染羊口疮的羊只发病症状相同，这也与何水林等[15]进行的动物感染试验结果相一致。由此可以证实，本次分离到的的陕西榆林地区病毒株为ORFV，为下一步进行ORFV弱毒疫苗研制和毒力相关基因的研究提供了重要的材料。

[1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:977.

[2]Yang H,Meng Q,Qiao J,et al.Detection of genetic variations in Orf virus isolates epidemic in Xinjiang China[J]. J Basic Microbiol,2014,54(11):1273-1278.

[3]Hosamani M,Bhanuprakash V,Scagliarini A,et al.Comparative sequence analysis of major envelope protein gene (B2L) of Indian orf viruses isolated from sheep and goats[J].Vet Microbiol,2006(116):317-324.

[4]Duan C,Liao M,Wang H,et al.Identification,phylogenetic evolutionary analysis of GDQY orf virus isolated from Qingyuan city,Guangdong province,southern China[J].Gene,2015(555):260-268.

[5]Li H,Zhu X,Zheng Y,et al.Phylogenetic analysis of two Chinese orf virus isolates based on sequences of B2L and VIR genes[J].Arch Virol,2013(158):1477-1485.

[6]张克山，何继军，尚佑军，等.羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析[J].畜牧兽医学报，2010,41(9):1154-1157.

[7]张瑜,高晶晖,张立强,等.杨凌某羊场羊口疮病毒的分离鉴定[J].动物医学进展,2015,36(1):61-65.

[8]高晶晖,张瑜,侯伟杰,等.羊口疮病毒威海株的分离鉴定[J].动物医学进展,2014,35(12):45-48.

[9]颜新敏,张强.羊口疮病毒的研究进展[J].中国动物检疫,2008,25(11),51-53.

[10]罗云,申之义.羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究[J].中国畜牧兽医,2007,34(1),94-96.

[11]Tikkanen M K,McInnes C J,MercerA A,et al.Recent isolates of parapoxvirus of Finnish reindeer (Rangifertarandus) are closely related to bovine pseudocowpox virus[J].J Gene Virol,2004,85(6):1413-1418.

[12]Bora D P,Barman N N,Das S K,et al.Identification and phylogenetic analysis of orf viruses isolated from outbreaks in goats of Assam,a northeastern state of India[J].Virus Genes,2012,45(1):98-104.

[13]Guo J,Rasmussen J,Wunschmann A,et al.Genetic characterization of orf viruses isolated from various ruminant species of a zoo[J].Vet Microbiol,2004,99(2): 81-92.

[14]Guo J,Zhang Z,Edwards J F,et al.Characterization of a North American orf virus isolated from a goat with persistent,proliferative dermatitis[J].Virus Res,2003,93(2):169-179.

[15]何水林,陈杰,蔡玉书,等.羊口疮病毒的分离与鉴定[J].中国兽医科技,2002,32(9):22-23.

Isolation and Identification of Orf Virus in a Goat Farm of Yulin Shaanxi

ZHOU Ming,YUE Jin-hua,LIU He-yuan,GAO Yang,LI Wen-li,YANG Qi-ming,CHEN De-kun

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

In order to obtain a wild strain of Orf virus in Yulin,samples of the lip scab from a lamb with clinical symptoms of Orf in a goat farm in Yulin city were collected.After grinded and repeated freezing and thawing,the supernatant was inoculated in calf testis primary cells by passage culture,and then the virus was identified as Orf virus through the observation of cytopathic effects,PCR detection and animal regression test.The results suggested that calf testis primary cells infected with scab by grinding fluid displayed cytopathic effects at the fourth passages,and the virus titer was 107.66TCID50/mL.B2L gene of isolated virus was cloned and sequenced,and the homologous analysis revealed an identity of 99% with Gansu (KC485343.1) strain and Fujian (KC568399.1) strain.The 2 month-old lambs were inoculated with the cell cultures for the infection experiment,and typical Orf clinic symptoms such as papules and pustules appeared in lips and inguen after virus inoculation.In conclusion,a wild strain of Orf virus in Yulin was isolated in this study.

Orf virus；isolation and identification；PCR；animal regression test

2016-02-28

陕西省科技统筹创新工程科技计划项目(2015KTTSNY04-04)

周铭(1990-)，女，陕西汉中人，硕士研究生，主要从事分子病原学与免疫学研究。*通讯作者

S852.659.1

A

1007-5038(2016)09-0031-04