禽呼肠病毒感染鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的动态变化

蓝元喜 ,谢芝勋，黄　莉，谢丽基，邓显文，范　晴，罗思思，谢志勤，黄娇玲，张艳芳，王　盛，曾婷婷

(1.广西大学动物科学技术学院 ，广西南宁 530004；2.广西壮族自治区兽医研究所/广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室，广西南宁 530001)



研究论文

禽呼肠病毒感染鸡胚成纤维细胞后Toll样受体mRNA转录水平的动态变化

蓝元喜1,谢芝勋2*，黄莉2，谢丽基2，邓显文2，范晴2，罗思思2，谢志勤2，黄娇玲2，张艳芳2，王盛2，曾婷婷2

(1.广西大学动物科学技术学院 ，广西南宁 530004；2.广西壮族自治区兽医研究所/广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室，广西南宁 530001)

为分析禽呼肠病毒(ARV) 标准毒株S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后对相关鸡Toll样受体(ChTLRs)mRNA转录水平的影响作用，利用实时荧光定量PCR，测定和分析ARV-S1133感染CEF后ARV结构蛋白σC和ChTLRs的mRNA转录水平变化情况。结果表明，ARV-S1133感染CEF 10 h后,ARV σC蛋白的mRNA相对表达量开始迅速上升，在48 h达到峰值；同时，感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA表达量发生显著变化，在感染72 h内各个受体的mRNA表达量呈波浪式变化。5个不同滴度的ARV感染CEF 24 h后，ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21 mRNA转录水平与病毒滴度均呈正线性相关。上述结果表明,ARV感染后可诱导CEF ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA转录水平发生变化，可能与禽呼肠病毒的复制和致病机制相关。

禽呼肠病毒；鸡Toll样受体；实时荧光定量PCR；转录水平

禽呼肠病毒(Avian reovirus，ARV)属于呼肠病毒科正呼肠病毒属成员，主要引起鸡病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、慢性呼吸道病、免疫抑制性疾病和吸收障碍综合征等，世界范围内广泛存在，给全球养禽业造成重大经济损失[1-2]。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类胚系编码的模式识别受体，通过识别病原微生物保守的分子相关模式，实现对外来病原体的早期识别，启动机体的天然免疫和引起获得性免疫反应，在抗感染免疫和激活获得性免疫中都发挥重要作用。目前研究表明，已经鉴定的鸡Toll样受体(chicken Toll-like receptors,ChTLRs)已超过10种，包括ChTLR3、ChTLR7、ChTLR21等，其中，ChTLR3能识别病毒dsRNA(呼肠病毒)或poly(I：C)，诱导相关转录因子的产生，调节免疫细胞因子的表达,介导天然免疫应答，进而使宿主抵御病毒的感染[3-4]；ChTLR7主要表达于B细胞、T细胞亚群以及树突细胞亚群等，可识别单链RNA病毒[5]； ChTLR21可以识别具有CpG结构单元的DNA病毒的DNA,可能与鸡抵抗病毒入侵有关[6]；ChTLR5主要在宿主防御微生物感染过程中发挥作用，ChTLR15是家禽中所特有的受体，其在细胞中的位置和配体识别机制尚不清楚[7]。ChTLRs能够识别入侵机体的外来病原体，其表达量并随之发生变化。因此，进行相关的ChTLRs表达水平监测，对研究疾病致病机制和机体免疫水平有重要意义。研究表明，禽流感、鸡传染性法氏囊病病毒感染后鸡ChTLR3基因的相对表达量发生明显变化[3]，还引起免疫器官中ChTLR7 mRNA转录水平上调[5]。马立克病病毒感染可影响鸡淋巴器官Toll样受体通路基因的表达量[8]。但目前有关ARV感染后ChTLRs在机体免疫反应中的作用研究较少。为了分析ARV感染后病毒与宿主细胞的相互作用以及调控相关ChTLRs表达情况，本研究利用已建立的ChTLRs实时荧光定量PCR方法检测ARV-S1133感染后CEF中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的转录水平动态变化[9-11]，为进一步研究ARV的致病机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1种蛋与试剂SPF种蛋，北京梅里亚公司产品；F-12 DMEM， Hyclone公司产品；胎牛血清，明海公司产品；RNA提取试剂RNAiso Plus 、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR○RPremix ExTaqTMⅡ宝生物工程(大连)有限公司产品；2×EasyTaqPCR SuperMix，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.2病毒和细胞禽呼肠病毒标准强毒株S1133株(ARV-S1133)，本实验室保存。参照《动物病毒学》中[12]CEF制备方法，采用10日龄SPF鸡胚制备鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)。

1.2方法

1.2.1病毒感染将制备好的CEF细胞置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养，24 h～36 h长成单层的CEF，弃培养基，用PBS洗涤2次后，分别接种不同滴度(105、104、103、102、101个TCID50)的ARV-S1133病毒液，37℃孵育1 h，弃病毒液，加入含20 mL/L胎牛血清的DMEM和F-12细胞培养液，继续培养，每个滴度设3个重复。同时，设置未感染对照组。

1.2.2收集细胞样品在1、2、4、6、8、10、12、16、24、36、48、60、72 h 分别收集未感染对照组和105个TCID50ARV-S1133感染细胞。其他滴度ARV感染组和对照组，在感染24 h后收集CEF细胞。收集方法：弃细胞培养液，用PBS 洗涤2次后,用刮铲刮取细胞冻存于-80℃备用。

1.2.3细胞总RNA抽提与反转录参照RNAiso Plus使用说明书和文献[13]提取各时间点CEF样品的总RNA。将总RNA重悬于35.0 μL DEPC水中，加入5×g DNA Eraser buffer、gDNA Eraser，42℃ 作用2 min以去除基因组DNA；再依次加入Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ、RT Primer Mix 4、5×PrimeScript buffer 2、RNase Free dH2O，混匀后于37℃ 15 min，85 ℃ 5 s进行反转录。制备好的cDNA于-30 ℃保存备用。

1.2.4实时荧光定量PCR对试验样品的测定根据本实验室已建立的鸡ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21和GAPDH，及ARV-σC基因的实时荧光定量PCR检测方法[9-11]，用罗氏lightcycle2.0实时荧光定量PCR仪检测细胞样品中各受体基因的表达情况，每份cDNA样品设3个重复。

1.2.5数据处理和统计分析经real-time PCR反应后,获得目的基因和看家基因GAPDH的Ct值。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT法计算各目的基因在不同时间点的相对表达量，并用Student t2方法进行统计分析。显著性差异分析水平为P<0.05，极显著性差异分析水平为P<0.01[14]。

2　结果

2.1ARV结构蛋白σС基因mRNA的转录水平变化

首先，为了明确ARV在CEF中的感染情况，检测ARV结构蛋白σС的mRNA转录水平(图1)。自ARV感染CEF后，ARV结构蛋白σСmRNA的相对表达量，在感染早期检测到σСmRNA的表达量， 10 h起快速上调，至48 h时显著升高且达到峰值，随后因细胞死亡脱落，ARV-σСmRNA的相对表达量下降。

图1　不同时相的ARV-σС基因mRNA的转录变化Fig.1　The levels of ARV-σС mRNA transcription in different timeafter ARV-s1133 infection

2.2ARV-S1133株感染CEF后ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的转录水平变化

105个TCID50的ARV-S1133株感染CEF后，ARV S1133株对CEF中ChTLRs转录水平的影响见图2。结果显示，与对照组相比，ARV-S1133株感染后，ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21mRNA在感染早期迅速表达上调，在整个细胞感染过程中呈波浪式变化。ChTLR3 mRNA在感染后1 h表达量略高于对照组，2 h表达量差异显著，6 h显著降低，随后12 h和24 h表达量显著升高且达到峰值(P<0.05)。ChTLR5 mRNA表达量在感染后1 h稍低于对照组，在10 h ChTLR5 mRNA的表达量极显著升高并达到峰值，随后24 h表达量显著升高，72 h表达量极显著升高(P<0.05或P<0.01)。ChTLR7 mRNA在感染1 h后表达量开始上调，6 h表达量显著升高并达到峰值，随后12 h表达量极显著低于对照组，但24 h显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。ChTLR15 m在感染后1 h表达量略高于对照组，4 h表达量显著升高并达到峰值，感染后12 h表达量极显著升高并达到峰值(P<0.05或P<0.01)达到峰值。ChTLR21 mRNA在感染后1 h表达量显著低于对照组， 2 h表达量差异显著上升，10 h表达量极显著上升并达到峰值，随后36 h ChTLR21 mRNA表达量显著上升并达峰值(P<0.05或P<0.01 )，其余时间点表达量变化不明显。

2.3不同滴度ARV感染24 h后ChTLRs的测定

为了研究ChTLRs的mRNA的表达量是否与ARV的感染滴度高低有关，real-time PCR检测了不同滴度的ARV感染CEF中ChTLRs的转录水平变化。结果见图3，结果表明所检测的这5种ChTLRs的表达量与感染ARV的毒价均呈正相关关系。

A.ChTLR3;B.ChTLR5;C.ChTLR7;D.ChTLR15;E.ChTLR21

图2CEF感染ARV后鸡Toll样受体(TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21)基因mRNA的动态转录水平

Fig.2Dynamics of the transcription of ChTLR3，ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21 genes in CEF after ARV infection

A.ChTLR3;B.ChTLR5;C.ChTLR7;D.ChTLR15;E.ChTLR21

图3不同毒价ARV感染 CEF 24 h 后鸡Toll样受体mRNA的转录变化

Fig.3The transcriptional profiles of Toll-like receptor mRNA in CEF after 24 h of infection with different doses of ARV

3　讨论

本试验利用real-time PCR检测了ARV感染72 h内各个时间点CEF中ChTLRs和ARV结构蛋白σС mRNA转录水平的变化，结果发现,ARV-σС在整个试验过程中均能检测到σС的表达，感染早期表达量较低，自10 h开始迅速升高,至48 h达到峰值。而所检测ChTLRs在ARV感染72 h内各个时间点CEF中表达量各有不同，其中ChTLR(3、5、7、15、21)5个受体表达量在不同试验时间点发生显著变化。

ChTLR3能识别双链RNA病毒，ARV感染CEF发现在感染早期上调，随着ARV增殖，ChTLR3 mRNA表达下降，但在感染后期，ChTLR3 mRNA表达量上升于24 h达到峰值。这与施蕾等高[3]通过用IBDV感染CEF结果发现ChTLR3在感染24 h后表达水平有明显增高相似。ChTLR5在宿主防御微生物感染过程中发挥作用，在ARV感染CEF 10 h升高达到峰值，感染ARV 10 h后，随着ARV的增殖ChTLR5表达量下降，48 h后ARV的下降，ChTLR5表达量又开始上调。ChTLR7可识别单链RNA病毒，表达量在ARV感染初期达到峰值，10 h后表达量被下调，在感染12 h下调至最低谷值，随后在24 h又上调，与弓莉等[5]IBDV感染引起免疫器官中TLR7 mRNA转录上调相似。ChTLR15为家禽特有的受体，其在细胞中的位置和配体识别机制尚未清楚，本试验中ChTLR15 mRNA表达量在ARV感染早期上调，在12 h显著升高并达到峰值，随后表达量变化不大，这与郭新凤等[14]IBDV感染早期上调法氏囊和外周血单核细胞ChTLR3/4/15 mRNA的 表达相似，ChTLR21可CpG结构单元的DNA病毒，本试验中ChTLR21 mRNA表达量在ARV感染早期迅速上调，10 h达到峰值，随后表达量下降，表达趋势与ARV-σС的表达趋势相反。

在本研究中，ARV感染组CEF整个过程中均有检测到ARV结构蛋白σС的表达，感染后期结构蛋白σС增殖趋势达到峰值，说明ARV已成功感染了CEF; 并且检测的5个受体ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA转录水平发生变化，且不同时间点上调幅度有所差别，说明这5个ChTLRs可能参与了ARV的致病过程。且在不同滴度病毒感染CEF后5个ChTLRs mRNA转录水平与病毒滴度正线性相关，说明了ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的表达可能与病毒的复制相关，但这5个ChTLRs在ARV感染过程的具体作用还有待进一步研究。

[1]Tang K N,Fletcher O J,Villegas P,et al.Comparative study of the pathogenicity of avian reoviruses[J].Avian Dis,1987,31:557-583.

[2]Montgomery R D,Villegas P,Dawe D L,et al.A comparison between the effect of an avian reovirus and infectious bursal disease virus on selected aspects of the immune system of the chicken[J].Avian Dis,1986,30(2):298-308.

[3]施蕾.TLR3在鸡传染性法氏囊病病毒感染过程中的作用[D].北京：首都师范大学,2007.

[4]金丹,吕凤林.TLR3免疫识别dsRNA病毒的分子机制[J].病毒学报,2005(2):155-159.

[5]弓莉，覃宗华，顾为望，等.传染性腔上囊炎疫苗免疫鸡TLR7基因表达的动态变化[J]. 中国兽医科学，2007，37(6)：486-491.

[6]甘珊珊,何秀苗,韦平.鸡Toll样受体研究进展[J].动物医学进展,2010，31(9):76-80.

[7]丁娜,孙英杰,丁铲.禽Toll样受体研究进展[J].中国动物传染病学报,2011(6):77-83.

[8]竭航.马立克氏病毒对鸡淋巴器官Toll样受体通路基因表达量的影响[D].四川雅安：四川农业大学,2013.

[9]Zhou Z Y,Hu S J,Wang Z Y,et al.Expression of chicken Toll-like receptors and signal adaptors in spleen and cecum of young chickens infected withEimeriatenella[J].J Integrat Agr,2014,Doi:10.1016/S2095-3119(13)60384-6.

[10]张昆丽,谢芝勋,黄莉,等.禽呼肠孤病毒感染对SPF鸡跗关节细胞因子mRNA转录的影响[J].畜牧兽医学报,2014(9):1505-1511.

[11]熊文婕,谢芝勋,唐熠,等.SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立[J].广西农业科学,2010(4):366-370.

[12]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:204-246.

[13]Lee M S,Chang P C,Shien J H,et al.Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR[J].J Virol Methods,2001,97(1/2):13-22.

[14]郭新风,王丽琼,李焕荣,等.IBDV感染对SPF鸡腔上囊与外周血单核细胞TLR3/4/15 mRNA表达的影响[J].中国兽医杂志,2012(10):12-16.

[15]张亚群,韩俊源,郭华,等.猪圆环病毒2型感染仔猪肺泡巨噬细胞Toll样受体mRNA转录的变化[J].畜牧兽医学报,2014(5):802-808.

Dynamic Changes of Toll-like Receptor mRNA Transcription Levels in Chicken Embryo Fibroblasts Infected with Avian Reovirus

LAN Yuan-xi1,XIE Zhi-xun2,HUANG Li2,XIE Li-ji2,DENG Xian-wen2,FAN Qing2,LUO Si-si2,XIE Zhi-qin2,HUANG Jiao-ling2,ZHANG Yan-fang2,WANG Sheng2,ZENG Ting-ting2

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530004,China; 2.Guangxi VeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnostic,Nanning,Guangxi,530001,China)

In order to analyze the mRNA transcriptic changes of chicken Toll-like receptors in ARV standard strain S1133-infected CEF cells,real-time PCR was used to analyze the mRNA transcriptic changes of ARV structural protein σC and chicken Toll-like receptors in ARV S1133-infected CEF cells. The results showed that the relative expression levels of ARV structural protein σC were elevated since 10 h post-infection,reaching a peak at 48 h post-infection.During this period,the mRNA transcriptic levels of ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21 genes were changed significantly in the infected CEF cells with different patterns.Meanwhile,the results of different ARV dose infection assay showed that the mRNA transcriptic levels of ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15and ChTLR21 genes were positively correlated with the virus doses.These data above suggest that ARV infection could effectively induce the mRNA expression changes of ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21.Furthermore,ChTLR3,ChTLR5,ChTLR7,ChTLR15 and ChTLR21 may play important roles in replication and pathogenic mechanisms of ARV.

Avian reovirus;chicken Toll-like receptor;real-time PCR;transcription level

2016-03-07

国家自然科学基金项目(31160512)；广西自然科学基金项目(2014GXNSFCA118006)；广西特聘专家专项项目(2011B020)；广西水产畜牧兽医局科技项目(桂渔牧科201452003)

蓝元喜(1989-)，男(壮族)，广西来宾人，硕士研究生，主要从事禽病防治与病原分子生物学研究。*通讯作者

S852.659.4

A

1007-5038(2016)09-0001-05