钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定

虞　勇， 李明辉， 刘桂剑， 李冰玉， 邹云增， 陈瑞珍

复旦大学附属中山医院心内科，上海市心血管病研究所中心实验室，上海　200032



·技术与方法·

钙蛋白酶抑制蛋白基因过表达Balb/C小鼠的繁育及鉴定

虞勇， 李明辉， 刘桂剑， 李冰玉， 邹云增， 陈瑞珍*

复旦大学附属中山医院心内科，上海市心血管病研究所中心实验室，上海200032

目的： 建立钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin, CAST)基因过表达Balb/C小鼠的培育方法，并探讨碱性裂解液提取基因组DNA在子代鼠基因型鉴定中的价值。方法： 将雄性C57BL/6-CAST+/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠杂交，将雄性CAST+/-杂合子代小鼠与雌性Balb/C野生型子代小鼠杂交，连续杂交至消除C57BL/6小鼠遗传背景。取子代小鼠鼠尾组织，采用碱性裂解液提取基因组DNA，PCR法扩增CAST基因片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。采用柯萨奇B3病毒(CVB3)感染Balb/C-CAST-/-小鼠以建立急性病毒性心肌炎小鼠模型。结果： C57BL/6-CAST+/-转基因小鼠与雌性Balb/C野生型小鼠连续杂交10代可消除C57BL/6小鼠遗传背景。采用碱性裂解液提取的基因组DNA数量、纯度能够满足后续实验需要，且产物大小与目的片段一致。成功建立Balb/C-CAST-/-基因型小鼠急性病毒性心肌炎模型。结论： 成功建立Balb/C-CAST基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；碱性裂解液提取基因组DNA简便、高效，值得推广。

钙蛋白酶；钙蛋白酶抑制蛋白；柯萨奇B3病毒；转基因；基因型鉴定

Calpain(钙蛋白酶)是主要存在于细胞质中的钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶，激活后能通过有限酶切割其底物，参与包括心血管疾病等的病理过程[1-2]。研究[3]发现，calpain在急性病毒性心肌炎(VMC)发病过程中被激活，介导柯萨奇B3病毒(CVB3)感染导致的心肌损伤。而calpain抑制剂表现出相应的器官保护作用[4]。

Calpain抑制蛋白(calpastatin, CAST)是calpain的内源性抑制剂。在心肌细胞内，两者共定位。CAST负向调控calpain的活性，在体内及体外过表达CAST均可抑制calpain活性[5]。转基因动物模型常用于致病机制的探讨及药物的筛选。2011年本研究室从加拿大西安大略大学病理生理学系彭天庆教授实验室引进了C57BL/6-CAST基因过表达小鼠。本研究通过C57BL/6-CAST基因过表达小鼠建立有稳定Balb/C遗传背景的CAST基因过表达模型，为后续研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要材料及试剂实验动物：C57BL/6-CAST+/-杂合子转基因小鼠雌、雄各1只(5～6周龄)，由加拿大西安大略大学病理生理学系彭天庆教授实验室；Balb/C雌性野生型小鼠(5～6周龄)购于复旦大学实验动物部。试剂：2×PCR Master mix、DNA Marker购自美国Thermo Fisher公司；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；小鼠心肌肌钙蛋白(cTnI) ELISA试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司。 CVB 3(Nancy株，由本实验室保存复制)，在Vero细胞中复制。基因组DNA裂解液配制：溶液A成分为25 mmol/L NaOH、0.2 mmol/L EDTA；溶液B成分为40 mmol/L Tris-HCl(pH值5.0)。小鼠组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。仪器：美国Thermo Fisher公司高速台式冷冻离心机；美国Bio-Rad公司PCR仪、电泳槽、ChemiDocMPSystem 全能型成像系统；美国Eppendorf紫外分光光度计。1.2Balb/C遗传背景CAST基因过表达小鼠的培育转基因小鼠饲养于复旦大学实验动物部，光照及黑暗每隔12 h交替，恒温、恒湿，自由饮水、进食，自然交配。采用1雄配3雌合笼的方法将雄性C57BL/6-CAST+/-小鼠与雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖。F1代子鼠在3周龄时与亲代分离，提取鼠尾DNA，用PCR方法鉴定并筛选CAST基因表达阳性小鼠。将雄性CAST基因表达阳性小鼠与雌性Balb/C近交系小鼠交配繁殖，获得的F2代雄性CAST+/-小鼠继续与雌性Balb/C近交系小鼠交配、繁殖，连续交配至获得遗传背景稳定的Balb/C-CAST基因过表达小鼠。具体繁殖方案见图1。

图1　Balb/C遗传背景CAST基因过表达小鼠繁育方法

1.3碱性裂解液提取子代小鼠基因组DNA及PCR鉴定子代小鼠断奶打耳号标记后，剪取1～2 mm鼠尾，采用碱性裂解液法提取DNA。将鼠尾放入1.5 mL EP管，加入50 μL溶液A，于金属浴上95℃孵育40 min，室温放置1.5 h，再加入50 μL溶液B，充分震荡混合，4℃ 10 000×g离心5 min，放4℃冰箱待用。基因组DNA提取试剂盒(北京天根)提取DNA按说明书进行。

基因组DNA扩增：CAST基因引物上游为5′-GTT GGC TTA GGC TGC TTT TCG T-3′；下游为5′-CCA GAC TCC GTG ACA CCC CTT-3′。目的基因片段长度为518 bp。PCR反应体系：2×PCR Master Mix 12.5 μL，Primer(25 μmol/L)0.4 μL，DEPC-H2O 10.1 μL，cDNA 2 μL；总体积25 μL。PCR反应条件：(1)预变性94℃，3 min；(2)变性94℃，30 s；(3)退火60℃,30 s；(4)延伸72℃，60 s；(5)重复步骤(2)～(4)40次；(6)延伸72℃，10 min；(7)4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳:用0.5×TBE缓冲液配置1%琼脂糖凝胶，加热融化，待温度降至60℃左右加入溴化乙啶(EB)1～2 μL(10 mg/mL)，混匀后铺板，室温放置30 min，待凝胶完全凝固后放入电泳槽。上样25 μL PCR样本+5 μL 6×Loading Buffer(共30 μL)，电压90 V，电泳40 min，使用Bio-Rad凝胶成像仪进行凝胶扫描。Eppendorf紫外分光光度计检测示各样本浓度为600～800 ng/mL，D260/280值为1.6～1.8。

1.4Balb/C-CAST-/-小鼠VMC模型的建立第10代同窝3～4周龄、基因型鉴定为CAST-/-的雄性小鼠腹腔注射100半数细胞培养感染量(TCID50)的CVB 3(0.1 mL/只)。对照组腹腔注射Eagle液(0.1 mL/只)，两组小鼠正常饲养7 d时断颈处死，取心肌组织在10%中性甲醛中固定，苏木精-伊红(H-E)染色观察心肌组织病变程度；取小鼠外周血分离血清，ELISA法检测外周血中cTnI含量。

2　结　果

2.1转基因小鼠造模结果结果(图2)表明：经过连续10代以上杂交，得到遗传背景稳定的Balb/C-CAST小鼠。

图2　不同遗传背景CAST基因过表达小鼠

A: C57BL/6-CAST基因过表达小鼠;B: 杂交F1代CAST基因过表达小鼠;C: 杂交F10 Balb/C-CAST基因过表达小鼠

2.2碱性裂解液法及试剂盒提取基因组DNA效果的比较结果(图3)表明：碱性裂解液提取的DNA与DNA提取试剂盒完全符合。

图3　杂交F10 Balb/C-CAST小鼠不同基因型

1～5：碱性裂解液法提取DNA；6：DNA marker; 7～11: 试剂盒提取DNA. 1,7:Balb/C-CAST+/-；2,8：Balb/C-CAST+/-；3,9： Balb/C-CAST-/-；4,10： Balb/C-CAST-/-；5，11： Balb/C-CAST+/-

2.3Balb/C-CAST-/-基因型小鼠VMC模型的建立同窝基因型鉴定为CAST-/-的3周龄雄性小鼠感染CVB 3造模后7 d，可见心脏表面有点状、片状白斑(图4)。H-E染色(图5)显示：心肌组织可见明显炎性病灶(炎性细胞浸润)，心肌纤维排列紊乱，局部钙化。与对照组小鼠相比，模型组小鼠外周血cTnI浓度显著上升[(5.87±3.03) ng/mLvs(0.23±0.24) ng/mL,P<0.01]。

图4　VMC小鼠心脏外观

图5　VMC小鼠心肌组织H-E染色

A～C:对照组；D～F: 模型组. Original magnification:×10(A,D); ×100(B,E); ×400(C,F)

3　讨　论

Calpain是多种疾病的潜在分子治疗靶点[6-7]。前期研究[3]已证实，calpain在VMC发病过程中被激活，介导CVB 3直接感染导致的心肌损伤。CAST是calpain的内源性抑制剂，通过其C末端的Ⅰ、Ⅳ结构域结合calpain，抑制calpain活性；同时通过其特定的氨基酸序列调节Ca2+通道的启闭，进而调控calpain活性[8]。

Balb/C小鼠是公认的VMC模型动物，而C57BL/6-CAST基因过表达小鼠因其C57BL/6小鼠遗传背景导致的免疫偏离不适合用作VMC模型[9]。因此，本研究将C57BL/6-CAST基因过表达小鼠与Balb/C小鼠杂交，以消除C57BL/6遗传背景。一般认为，通过至少10代的杂交，同类系基本可以去除C57BL/6小鼠遗传背景；8代及以上代数的种群小鼠，可基本认为遗传背景一致[10]。本研究以第11代同窝3周龄基因型鉴定为Balb/C-CAST-/-的雄性小鼠感染CVB 3制作VMC小鼠模型，5只小鼠造模成功。

本研究采用碱性裂解液裂解法提取DNA，所用试剂均为常规化学试剂，不需用蛋白酶K，DNA得率较高、成本低廉；不使用酚、氯仿等试剂，不污染环境；不需要匀浆操作，避免交叉污染；鉴定结果与试剂盒提取的DNA一致。此外，使用碱裂解法提取DNA能节约实验经费，尤其节约大批量小鼠基因型鉴定所需费用。本研究室自2012年起使用该方法对转基因/基因敲除小鼠进行基因型鉴定，取得了稳定、可靠的鉴定结果，证明其是一种高效、低成本的解决方案，能够满足后续实验的需要。

综上所述，本研究成功建立Balb/C-CAST基因过表达小鼠，为后续研究奠定了基础；碱性裂解液提取基因组DNA高效、可靠、低成本，值得推广。

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[本文编辑]叶婷， 贾泽军

Breeding and identification of calpastatin gene overexpression in Balb/C mice

YU Yong, LI Ming-hui, LIU Gui-jian, LI Bing-yu, ZOU Yun-zeng, CHEN Rui-zhen*

Laboratory of Cardiovascular Disease Research Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To establish breeding methods of calpastatin (CAST)gene overexpression in genetic background of Balb/C mice, and to investigate the application value of alkaline lysis solution extracted genomic DNA in genotyping.Methods： The C57BL/6-CAST+/-male mice were hybridized with Balb/C wild type female mice. In the filial generations,CAST+/-heterozygous male mice were hybridized with Balb/C wild type female mice, continuous hybridization until C57BL/6 genetic background was removed. The genomic DNA was extracted from mice tails, and CAST gene fragment was amplified by PCR, the results were identified by agarose gel electrophoresis. The Balb/C-CAST-/-mice were infected with coxsakievirus(CVB3)to establish the mouse model of acute viral myocarditis.Results： The C57BL/6 genetic background can be removed by the method of C57BL/6- CAST+/-mice countinously hybridized with Balb/C wild type female mice for 10 generations. The alkaline lysis solution extracted genomic DNA amount, purity can fulfill the needs of following experiments, and the sizes were accordance with target fragment. The Balb/C-CAST-/-micemodel of acute viral myocarditis was succesfully established.Conclusions： The Balb/C-CAST gene overexpression transgenic mice is establishes the foundation for following experiments, the use of alkaline lysis solution to extract genomic DNA is easy, effective, which is worth for promotion.

calpain; calpastatin; coxsakie virus group B type3; transgenic; genotyping

2016-02-03[接受日期]2016-06-04

国家自然科学基金(31070786). Supported by National Natural Science Foundation of China(31070786).

虞勇，主管技师. E-mail: yu.yong1@zs-hospital.sh.cn

Corresponding author).Tel: 021-64041990-8543,E-mail: chen.ruizhen@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160117

R 542.2+1

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