家兔脑动脉粥样硬化性狭窄模型的建立

田春鸥， 张　鑫， 袁　媛， 李子付， 张永鑫， 张　磊， 赵　瑞， 杨志刚*

1.第二军医大学长海医院神经外科，上海　200433 2.解放军第四二二中心医院神经外科，湛江　524005 3.同济大学医学院，上海　200092 4.上海华佳医院，上海　200433



·论著·

家兔脑动脉粥样硬化性狭窄模型的建立

田春鸥1,2△， 张鑫3△， 袁媛4， 李子付1， 张永鑫1， 张磊1， 赵瑞1， 杨志刚1*

1.第二军医大学长海医院神经外科，上海200433 2.解放军第四二二中心医院神经外科，湛江524005 3.同济大学医学院，上海200092 4.上海华佳医院，上海200433

目的： 探索建立稳定的家兔脑动脉粥样硬化性狭窄模型的方法。方法： 将25只新西兰大白兔随机分成3组：对照组5只，普通饲料喂养，行股动脉切开手术；单纯高脂饲料喂养组10只，高脂饲料喂养并行股动脉切开手术；高脂喂养联合球囊损伤组10只，高脂饲料喂养并行经股动脉血管内椎动脉颅内段球囊损伤术。各组手术均在适应性喂养2周后实施，术后继续以原饲料喂养。分别在术后2周和4周行目标椎动脉数字减影血管造影术(digital subtraction angiography，DSA)，并进行血脂水平检测及病理组织学检查。结果： 对照组与单纯高脂饲料喂养组的目标椎动脉DSA及血管病理切片均未发现明显差异。高脂喂养联合球囊损伤组术后2周DSA提示，3例有目标段椎动脉轻度管腔狭窄，6例仅见管壁毛糙；术后4周DSA提示，5例可见目标段椎动脉管腔轻度狭窄，2例管腔中度狭窄，2例仅管壁毛糙。血脂水平检测显示，高脂喂养的两个实验组动物血脂水平高于对照组(均P<0.05)，单纯高脂喂养组与高脂喂养联合球囊损伤组的血脂水平差异无统计学意义。病理检查提示，高脂喂养联合球囊损伤组可见目标段椎动脉内皮结构紊乱，连续性中断，内膜下见泡沫细胞沉积。结论： 通过高脂喂养联合血管内球囊损伤，可成功建立较为稳定的家兔脑血管粥样硬化性狭窄模型，为后续研究奠定了基础。

家兔模型；球囊损伤；颅内动脉粥样硬化

动脉粥样硬化造成的脑供血动脉狭窄是发生缺血性卒中的重要原因之一。与西方人种不同，中国人脑供血动脉狭窄中，颅内狭窄所占比例较高[1-2]。颅内血管(包括颈动脉)与外周血管的结构明显不同，且病理标本较难取得，又缺乏合适的动物模型。因此，与颈动脉粥样硬化性狭窄相比，颅内动脉粥样硬化性狭窄的相关研究比较滞后。为了深入研究颅内动脉粥样硬化性狭窄，提高临床疗效，需要探索实用稳定的脑血管动脉粥样硬化狭窄动物模型的建立方法。

本研究采用高脂饲料喂养联合球囊损伤法，在家兔椎动脉颅内段模拟动脉粥样硬化狭窄病变，从而建立一种新型的家兔脑血管粥样硬化模型，以期为后续研究提供基础。

1　材料与方法

1.1主要材料及试剂雄性新西兰白兔25只，16～18周龄，体质量1.5～2.0 kg，由海军医学研究所动物中心提供[许可证号为SCXK(沪)2010-0029]。高脂饲料配方：基础饲料75%、胆固醇5%、猪油11%、蛋黄粉8%、丙基硫氧嘧啶0.5%和胆酸钠0.5%。球囊(商品名为Gateway，1.5/9 mm规格，即直径为1.5 mm，长度为9 mm)购自美国Boston Scientific公司。碘海醇注射液(欧乃派克350)为通用电气药业(上海)有限公司产品。

1.2方法

1.2.1动物分组25只家兔随机分为对照组(5只)、单纯高脂喂养组(10只)和高脂喂养合并球囊损伤组(10只)。所有动物均在20～25℃、50%～70%湿度条件下单笼喂养，昼夜12 h循环。对照组动物给予基础饲料(120～140 g/d)喂养，2个实验组动物给予高脂饲料(120～140 g/d)喂养。适应性喂养2周，确认家兔状态良好后建模。

1.2.2麻醉采用耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠(20 mg/kg)的方法麻醉实验动物。

1.2.3血管内皮球囊损伤动物取仰卧位，固定在手术台上，常规备皮消毒铺单，切开暴露股动脉，5F鞘置入股动脉内，鞘内注射100 U/kg肝素进行全身肝素化，5F导引导管在导丝的辅助下超选至右侧椎动脉开口处，选用Gateway球囊在微导丝辅助下经导引导管超选至右侧椎动脉颅内段，固定微导丝。在路图下，缓慢充盈球囊(充盈压力为3～4 atm，1 atm=101.325 kPa)，缓慢拖动球囊回撤移动5 mm，泄球囊。相同部位重复上述操作3次。撤出球囊，造影确认椎动脉通畅。撤出导引导管，拔除股动脉鞘，结扎术侧股动脉远近端，缝合皮肤。对照组及单纯高脂喂养组仅行股动脉分离暴露及结扎；对照组同时取血，检测血脂水平，作为血脂水平基线值。

1.2.4术后处理各组实验动物在麻醉后给予青霉素5万U单次肌肉注射以预防感染，手术后动物继续以原饲料喂养。

1.3观察指标

1.3.1影像学检查各组动物于术后2、4周分别行数字减影血管造影术(digital subtraction angiography，DSA)。观察家兔目标椎动脉的管壁情况及狭窄程度。狭窄程度分为轻度狭窄(<50%)、中度狭窄(50%～70%)及重度狭窄(70%～99%)。

1.3.2血液生化检查于术后4周行DSA，各组家兔经耳缘静脉抽取静脉血，4℃离心(875 ×g)15 min，以获得上层血清。检测血清中总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平。

1.3.3组织学检查术后4周DSA复查后，给予动物过量麻醉，用0.9%NaCl溶液以100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)通过左心室进行灌注，取主动脉弓及目标椎动脉以40%甲醛溶液固定，行组织病理学检查，切片后行H-E染色及RAM 11兔单核细胞抗体染色分析。

2　结　果

2.1一般情况单纯高脂喂养组中有1只动物在假手术后3 d开始纳差、精神萎靡，1周后死亡，考虑感染可能。高脂喂养联合球囊损伤组动物术中死亡1例，原因为超选过程中导引导管损伤，导致椎动脉开口处出血。其余动物手术过程顺利，术后均健康存活。2.2DSA检查结果术后2周脑血管造影提示，对照组及单纯高脂喂养组的椎动脉颅内段无变化；高脂喂养联合球囊损伤组的损伤局部均可见管壁欠光滑，内膜狭窄成功率为100%(9/9)，其中3例可见轻度管腔狭窄、6例无明显管腔狭窄。

术后4周造影提示，对照组及单纯高脂喂养组的椎动脉无明显变化；高脂喂养联合球囊损伤组的内膜损伤局部椎动脉管壁欠光滑，5例可见管腔轻度狭窄，2例管腔中度狭窄，狭窄模型的成功率为77.8%(7/9)，所有狭窄均为局限性狭窄(图1)。

图1　高脂喂养联合球囊损伤家兔椎动脉造影

A：球囊损伤术后即刻造影，椎动脉颅内段显影无明显异常；B：球囊损伤术后2周造影，可见目标血管管壁略毛糙，管腔可见轻度狭窄(箭头所示)；C：球囊损伤术后4周造影，可见目标血管管腔中度狭窄(箭头所示)

2.3血液生化检查血脂水平检测结果见表1。对照组家兔术后4周血脂水平(包括总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白)与基线水平比较，无统计学意义(t值分别为2.59、1.42、2.75，P值分别为0.06、0.23、0.052)。3组间术后4周的血脂水平存在差异(Kruskal-Wallis检验，P<0.05)；单纯高脂喂养组与高脂喂养联合球囊损伤组血脂水平差异无统计学意义；两实验组家兔术后4周(即高脂喂养后6周)的血脂水平均高于对照组(Mann-Whitney检验，P<0.05)。2.4组织病理学检查H-E染色结果提示，对照组与单纯高脂喂养组目标椎动脉无粥样硬化改变；与对照组相比，单纯高脂喂养组主动脉内皮下可见泡沫细胞沉积，而椎动脉颅内段未见粥样硬化改变。高脂喂养联合球囊损伤组可见目标椎动脉内皮连续性中断，内膜下见增大空泡样细胞沉积，发生率为100%(9/9)；进一步行RAM 11兔单核细胞抗体染色，证实增大空泡样细胞为泡沫细胞(图2)。

表1　术后4周各组家兔的血脂水平比较　(，mmol/L)

基线值：取对照组术时血脂水平.*P<0.05与对照组相比

图2　高脂喂养联合球囊损伤组家兔椎动脉组织病理检查

A, B：H-E染色20倍镜(A)及40倍镜(B)下视野观察，可见椎动脉内皮连续性中段，内皮下大量空泡样细胞；C, D：RAM11兔单核细胞抗体染色20倍镜(C)及40倍镜(D)下观察，证实内皮下的空泡样增大细胞为泡沫细胞

3　讨　论

中国人颅内血管粥样硬化性狭窄的发病率约为欧美人的3倍，因此深入研究颅内粥样硬化性狭窄对提高中国人健康水平很重要。颅内血管内膜薄弱，缺少外弹力层，与外周血管结构明显不同，两者引起脑梗死的机制也有明显差别[3-4]。因此，为加强对颅内血管动脉粥样硬化的研究，建立颅内血管的粥样硬化动物模型就显得尤为重要。本研究综合考虑成本及进行血管内干预治疗的可行性后认为，家兔不仅有与人类相似的脂肪代谢过程，而且其具有对粥样硬化的易感性及体型较小的优势，因此可以将其作为合适的动物选择。

单纯高脂喂养可以造成家兔的血脂水平升高[5]，形成粥样硬化，但粥样硬化的形成部位多在大的弹性血管，且位置不固定。为了建立定位明确的动脉粥样硬化模型，已有多项研究探索了在高脂喂养的基础上附加其他处理的方法，如选择性腔内球囊损伤内膜法、暴露并空气干燥或液氮损伤局部血管内膜法、暴露后以电刺激血栓形成仪刺激或液氮刺激血管法等[6-9]，其核心均是造成血管内膜的定位性损伤。而对于颅内血管，暴露并直接观察血管的做法不可取。随着材料学的不断进步，目前已有了可用于颅内血管的高顺应性小规格球囊。本研究采用高脂喂养联合高顺应性球囊(Gateway)损伤内膜的技术建模，成功率为90%；局部血管造影可见病变，其中内膜不光整率为100%，管腔狭窄率达77.8%；病理检查可见粥样硬化改变率为100%，证明该建模方法具有较高的可行性。

对家兔的颅内血管进行损伤，有较高的技术要求。造模过程中需要注意以下几个问题。(1)建议选择右侧椎动脉。与人类不同，家兔主动脉弓较窄，左侧锁骨下动脉开口与主动脉弓反向成角，导引导管不易稳定，而右侧延长线则与胸主动脉的延长线几乎呈直线关系，方便导管到位。(2)目标血管选择椎动脉颅内段。本研究一开始曾尝试选择基底动脉，虽然基底动脉的直径略大于椎动脉颅内段，但由于径路较远，家兔椎动脉直径较细，导引导管无法到更高的位置。本研究中死亡的1例家兔即由于尝试超选基底动脉的过程中未能提供更好的导引导管支撑，导致椎动脉开口处损伤出血。(3)颅内高顺应性球囊是较好的球囊选择。我们曾尝试使用冠脉小球囊，但因为其顺应性较差而无法到位。Gateway 1.5/9 mm是目前可用的最小规格的颅内球囊，虽然其直径(1.5 mm)仍大于椎动脉颅内段直径(平均略<1 mm)，但因其较高的顺应性，可在较低的压力下充盈，避免损坏血管。(4)动物的体位。在实际操作过程中，可以根据造影所见的血管角度，对家兔体位进行适当调整能提高到位的成功率。通常情况下，可使家兔的头部适当左斜，由前肢向外下轻度牵拉，以拉直椎动脉前开口。(5)股动脉穿刺点的处理。进行血管内操作，一般需要5F的股动脉鞘管，故直接穿刺成功率较低。常规的方法是初次球囊损伤血管内皮及后续随访均切开股动脉置鞘，这样会损伤双侧股动脉，给后续治疗造成困难。因此本研究进行内皮损伤建模时切开股动脉置鞘，但随访时经耳缘静脉造影，避免损伤家兔的另一侧股动脉，为进一步的治疗提供便利。这虽然导致影像质量略下降，但仍能满足评估的需要。我们也尝试设计了可以留置于一侧股动脉的装置。该装置可以使内皮损伤建模及后续随访时重复利用同一血管，保证影像质量的同时保留对侧股动脉。

本研究采用高脂喂养联合低压球囊损伤血管内皮的方法建立了脑血管粥样硬化性狭窄的动物模型，虽然成功率较高，但狭窄程度较轻，难以造成目标脑动脉的重度狭窄，且本研究所建立的粥样硬化模型的病理类型表现较单一，未见纤维性斑块或钙化以及坏死等粥样硬化改变[10]。若加大高脂饮食中胆固醇的比例、延长高脂饮食时间，则常导致动物因脂质在多脏器内沉积，发生肝硬化而死亡。因此，采用何种方法制作病理类型更加多样化且狭窄程度更重的脑血管粥样硬化性狭窄动物模型，还有待进一步的探索。

综上所述，本研究通过高脂饲料喂养联合血管内膜球囊损伤的方法建立了脑动脉粥样硬化性狭窄的家兔动物模型。该方法稳定、重复性较好、可行性高，可应用于颅内动脉粥样硬化的实验研究；但如何使模型的病理类型更类似人类，以及如何形成重度狭窄等问题还有待解决。

[1]Liu CY, Chen CQ.Intra- and extracranial atherosclerotic stenosis in China: epidemiology, diagnosis, treatment and risk factors[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(22):3368-3379.

[2]Wang Y, Zhao X, Liu L,et al. Prevalence and outcomes of symptomatic intracranial large artery stenoses and occlusions in China: the Chinese Intracranial Atherosclerosis (CICAS) Study[J]. Stroke, 2014, 45(3):663-669.

[3]Lee PH, Oh SH, Bang OY, et al. Infarct patterns in atherosclerotic middle cerebral artery versus internal carotid artery disease[J]. Neurology, 2004, 62(8):1291-1296.

[4]丁建平,华扬,凌晨, 等.缺血性脑卒中患者动脉粥样硬化分布的临床研究[J]. 中国现代神经疾病杂志, 2006, 6(4):266-270.

[5]Fan J, Kitajima S, Watanabe T, et al.Rabbit models for the study of human atherosclerosis: from pathophysiological mechanisms to translational medicine[J].Pharmacol Ther, 2015, 146:104-119.

[6]胡岗珠, 岳增辉, 杨俊, 等. 家兔动脉粥样硬化球囊损伤模型的制备过程与分析[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2014, 12(5):593-594.

[7]李秋梅, 王硕仁, 赵明镜,等. 家兔新型动脉粥样硬化狭窄模型的建立及其动态观察[J]. 中国实验动物学报,2004,12(1):25-28.

[8]Fang SM, Zhang QH, Jiang ZX. Developing a novel rabbit model of atherosclerotic plaque rupture and thrombosis by cold-induced endothelial injury[J].J Biomed Sci, 2009, 16:39.

[9]艾志兵, 何国厚, 李承晏,等. 家兔颈动脉粥样硬化模型的建立[J].卒中与神经疾病,2005,12(2):96-99.

[10]Mehrad H, Mokhtari-Dizaji M, Ghanaati H, et al.Developing a rabbit model of neointimal stenosis and atherosclerotic fibrous plaque rupture[J]. J Tehran Heart Cent, 2011, 6(3):117-125.

[本文编辑]廖晓瑜， 张艺鸣

Development of atherosclerotic intracranial arterial stenosis model of rabbits

TIAN Chun-ou1,2△, ZHANG Xin3△, YUAN Yuan4, LI Zi-fu1, ZHANG Yong-xin1, ZHANG Lei1, ZHAO Rui1, YANG Zhi-gang1*

1.Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 2.Department of Neurosurgery, No. 422 Hospital of PLA, Zhanjiang 524005, Guangdong, China 3.Tongji Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China 4.Shanghai Huajia Hospital, Shanghai 200433, China

Objective： To provide a simple and replicable method of building an atherosclerotic intracranial arterial stenosis model of rabbits.Methods： Twenty-five New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups. Five rabbits in control group were fed with normal diet and received sham arteriotomy of femoral artery.Ten rabbits in pure high-fat diet group were fed with high-fat diet and received sham arteriotomy of femoral artery. Ten rabbits in balloon-injury group were fed with high-fat diet and underwent endovascular balloon-injury operation of intracranial vertebral artery through femoral artery. All the operations were performed after two weeks of adaptive feed. Each group was fed with previous diet after operation. Digital subtraction angiography (DSA) of target vertebral artery was performed two and four weeks after operation(four and six weeks after the scheduled diet). Serum lipid level was test and the histopathologic examinations were performed.Results： No significant difference was found by DSA or pathological detection of blood vessel in target vertebral artery of control group and pure high-fat diet group. DSA revealed the mild luminal stenosis in three cases and unsmooth inner wall in six cases at the target vertebral arteries in balloon-injury group two weeks after operation. Also the DSA revealed the mild luminal stenosis in five cases, moderate luminal stenosis in two cases and unsmooth inner wall in two cases in balloon-injury group four weeks after operation.Detection of serum lipid level showed that the serum lipid level of white rabbits in pure high-fat diet group and balloon-injury group was significantly higher than that in control group (P<0.05). No significant difference of serum lipid level was found between pure high-fat diet group and balloon-injury group. Histopathologic examination showed the disorder of endothelial structure in target vertebral arteries, interruption of endothelial continuity and deposition of foam cell under intima in the high-fat diet combined balloon-injury group. Conclusions： The method of high-fat diet combined with endovascular balloon-injury is beneficial to successfully build a relatively stable model of rabbits atherosclerotic intracranial arterial stenosis, and it provides the basis for further studies.

rabbit model; balloon injury; intracranial atherosclerosis

2016-01-06[接受日期]2016-07-11

上海市科技创新行动计划实验动物研究项目(13140903202)，上海市医学引导项目(14411967600). Supported by Shanghai Science and Technology Innovation Action Plan for Laboratory Animal Research (13140903202)and Shanghai Medical Guidance Project(14411967600).

田春鸥，博士生，主治医师. E-mail: tianchunou@126.com；张鑫，同济大学医学院临床医学专业2013级本科生. E-mail: zhang_xin9313@163.com

Corresponding author). Tel: 021-31166666, E-mail: renzh1979@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160023

R 543.12

A

△共同第一作者(Co-first authors).