两个豚鼠品系速发型哮喘模型中组胺受体的表达及对肺功能的影响

卫　振, 娄绘芳, 吴　凯, 陈雁虹, 谢　敏, 刘迪文, 谢强敏（浙江大学实验动物中心, 杭州 310058）

两个豚鼠品系速发型哮喘模型中组胺受体的表达及对肺功能的影响

卫振, 娄绘芳, 吴凯, 陈雁虹, 谢敏, 刘迪文, 谢强敏
（浙江大学实验动物中心, 杭州 310058）

目的建立Zmu-1：DHP和DHP两个豚鼠品系的速发型哮喘模型，探讨组胺受体1（H1R）和组胺受体2（H2R）在肺组织中的表达及对肺功能的影响。方法两个豚鼠品系分别设置模型组（MW，MP）和对照组（BW，BP），模型组采用卵清白蛋白（OVA）致敏，对照组使用生理盐水。第1，14日致敏豚鼠，第28日用OVA雾化激发，记录0～8 min内动态肺顺应性（Cdyn）和气道阻力 （Raw） 变化。取肺组织样品，进行H1R和H2R mRNA表达检测和免疫组织化学分析。结果OVA雾化激发后，Zmu-1：DHP和DHP品系模型组（MW，MP） Cdyn下降，Raw上升，变化幅度先大后小，约3 min 达到最大，而两品系对照组（BW，BP）变化较小。其中，MW组反应较MP组更敏感。定量PCR分析, MW模型组的H1R, H2R mRNA表达量高于对照组BW（P＜0.05, P＜0.05），肺组织切片HE染色，模型组（MW，MP）肺泡间可见明显的炎症细胞浸润，而对照组（BW，BP）未见。免疫组织化学可见，H1R和H2R主要分布在气道和血管周围的平滑肌上。结论速发型哮喘模型，H1R 和H2R主要分布在肺部气管周围的平滑肌上，H1R的高表达与哮喘模型的气道敏感性密切相关。

哮喘； 卵清白蛋白（OVA）； 组胺受体； 肺功能； 豚鼠

哮喘是常见的呼吸系统疾病，患者常表现出气道狭窄，呼吸受阻的发病症状，其本质是在外界因素刺激下，机体表现出的一系列免疫反应［1］。豚鼠常被用来制作哮喘动物模型，用以模拟哮喘病人发病的不同阶段［2］。作者在实验时发现，不同品系豚鼠对组胺刺激的表现存在差异，Zmu-1： DHP品系比DHP豚鼠更敏感。在过敏反应中，组胺可通过与组胺受体（HR）相结合，引起气管的收缩［3］。分布于肺部气管的组胺受体有H1R和H2R，H1R被认为与平滑肌的收缩有关，H2R则有舒张作用［4］。本实验使用Zmu-1：DHP和DHP豚鼠品系制作速发型哮喘模型，检测肺组织中H1R和H2R的mRNA表达，免疫组织化学分析H1R和H2R在肺组织中的分布情况，以期望了解两品系H1R，H2R的表达与气道敏感性的关系。

1　材料与方法

1.1实验动物

普通级雄性Zmu-1： DHP和DHP豚鼠由浙江大学实验动物中心提供［SCXK（浙） 2012-0052］, 体质量250～350 g, 共48只, 每个品系设模型组（MW，MP）和对照组（BW，BP），12只/组，饲养于普通级环境［SYXK（浙）2012-0178］。

1.2试剂和仪器

卵清白蛋白（OVA）： 美国Sigma公司, 批号A5253；无水氯化铝Al（OH）3： 国药试剂，批号20130609； 氢氧化钠：国药试剂，批号20140107； 乌来糖，国药试剂，批号20130918；定量PCR试剂： Takara公司，批号，AK901、AK4401和AK3101；H1R一抗：Proteintech Group公司， 批号13413-1-AP；H2R一抗，Everest Biotech公司，批号EB06905。Medlab生物信号采集系统，南京美易科技有限公司，型号MedLab-U/4C501H。QPCR仪，Bio-rad公司，CFX-96。

1.3OVA哮喘模型的建立

参考《药理学实验指导》［5］, 模型组采用OVA致敏，对照组使用生理盐水。第1日，模型组左右腹股沟分别肌肉注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL, OVA氢氧化铝生理盐水凝胶［含质量分数1%OVA，4%Al（OH）3］。第14日加强致敏，腹腔注射OVA生理盐水凝胶, 0.5 mL/只。第28日，1%OVA生理盐水凝胶雾化激发（20 s）后，描计1～8 min肺功能。

1.4肺功能检测

质量分数15%乌来糖生理盐水溶液按照1 mL/ 100 g的剂量ip麻醉豚鼠。豚鼠行气管插管后, 置于容积描记箱内。1% OVA生理盐水雾化20 s，Medlab生物信号采集处理系统记录0～8 min内豚鼠的动态肺顺应性（Cdyn） 和气道阻力（Raw）。肺功能改变用Cdyn下降百分率和Raw值增加百分率计算。计算公式如下：

1.5解剖与取材

豚鼠股动脉放血处死，取左侧第一叶肺，剪取2份，用于mRNA检测；剪取左侧第二叶肺，质量分数4%中性甲醛固定，用于HE染色和免疫组织化学观察。

1.6QPCR检测

参照Taka ra产品说明书，提取总RN A， nanodrop检测RNA质量（吸光度比值A260/A280在1.8～2.0）和浓度, 调整到同一浓度, 反转录为cDNA,使用Takara SYBR配制反应体系, 上机。引物序列如下, GAPDH, F： 5-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3；

R： 5-TCCACAACCGACACATTAGG-3

H1R, F： 5-CCCAACACCTCGTGGACAT-3；

R： 5-TCACAGCACCTGCCATCTC-3

H2R T： 5-TCAAGATCGCTCGGGAACA-3

R： 5-TCAGCCCACGGTAAACAAA-3。

1.7统计方法

采用SPSS16.0进行数据分析，多因素方差分析使用Univariate程序，组间多重比较使用Post Hoc程序，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1豚鼠OVA雾化后豚鼠Cdyn和Raw的变化

1%OVA生理盐水雾化激发（20 s）后，模型组（MW，MP）Cdyn下降幅度先高后低, 在3 min达到最大； 而对照组（BP, BW）变化幅度较小。在1 min、2 min、3 min，模型组（MP, MW） Cdyn下降幅度都显著高于对照组（BP，BW）（P＜0.01）。在1～6 min, Zmu-1： DHP品系模型组Cdyn变化幅度高于DHP品系，但都未达到显著水平（表1）。

表1　OVA雾化后豚鼠Cdyn变化

1%OVA生理盐水雾化20 s后，模型组（MW，MP） Raw增加幅度先高后低, 在3 min达到最大； 而对照组（BP, BW）变化幅度较小。在1～6 min，模型组（MP, MW） Raw改变幅度高于对照组（BP，BW）, 但都未达到显著水平（表2）。

2.2豚鼠肺组织中H1R、H2R的mRNA表达检测

随着OVA刺激, 两品系哮喘模型（MP，MW）的H1R, H2R表达量均增加。模型组MW的H1R和H2R mRNA表达量高于对照组BW（P＜0.05, P＜0.05）,模型组MP的H1R和H2R RNA表达量高于对照组BP（P=0.056, P＜0.05）。在模型组和对照组, Zmu-1∶DHP品系的H1R，H2R基因表达量均高于DHP品系，但未达到显著水平（表3）。

表2　OVA雾化后豚鼠Raw变化

表3　豚鼠肺组织H1R和H2R的mRNA相对表达量

2.3豚鼠肺组织病理切片和组织化学分析

HE染色病理切片分析，模型组（MW, MP），肺泡可见有明显的炎性细胞浸润，而对照组（BW，BP）很少（图1）。免疫组织化学可见，H1R和H2R主要分布在肺组织气道和血管周围的平滑肌上，H1R的表达多于H2R（图2和图3）。

图1　豚鼠肺组织病理学观察

3　讨论

3.1激发实验豚鼠肺功能的变化

图2　豚鼠肺组织H1R免疫组织化学

图3　豚鼠肺组织H2R免疫组织化学

本实验激发检测时， Zmu-1∶DHP和DHP两个豚鼠品系，模型组对刺激反应敏感，表现为Cdyn先下降后恢复，Raw先增加后恢复, 其中, Zmu-1∶DHP品系比DHP品系改变幅度更大，体现出该品系在速发型哮喘模型激发实验中更容易模拟出气道敏感的性状。本实验模型组在3 min时Cdyn 和Raw出现最大改变，Xie等［6］在豚鼠的药物实验时显示，致敏豚鼠激发后在4 min时Cdyn 和Raw的改变达到最大，药理学指南［5］指出豚鼠速发型哮喘模型激发实验Cdyn 和Raw最大改变常在3～5 min出现。卫振等［7］在体外气管条检测不同豚鼠品系对组胺的敏感性，当组胺浓度为10-5mol/L和10-4mol/L时, Zmu-1∶DHP品系豚鼠气管条的收缩率显著高于DHP品系（P＜0.01～0.05），从离体角度验证了Zmu-1∶DHP和DHP品系对外界刺激反应敏感性的差异。

3.2H1R和H2R的组织分布和表达

本实验定量PCR检测，Zmu-1∶DHP和DHP两个品系，模型组肺组织中H1R的mRNA相对表达量比对照组增加明显，揭示哮喘模型组H1R的表达量增加。两个品系模型组H2R的mRNA表达量都显著升高（P＜0.05，P＜0.05），揭示模型组H2R的表达上升。

分布于肺部气管的组胺受体主要有H1R和H2R，H1R被认为与平滑肌的收缩有关［3］，在气道反应中起主导作用，H2R则有一定的舒张作用［4］。本实验中，模型组肺组织中H1R表达量上升，与模型气道反应敏感的实验结果一致。模型组肺组织中H2R表达量上升，但仍然不能够改变本实验中模型组气道反应敏感的表现。免疫组织化学分析表明，H1R和H2R主要分布在肺部气管和血管的平滑肌上，H1R的表达量明显多于H2R，外界刺激可能通过H1R和H2R作用于模型组支气管，从而引起肺功能的改变。

哮喘的本质是炎症反应, 在反应的早发相阶段,肥大细胞和嗜碱粒细胞释放出组胺，类胰蛋白酶等介质［8］。组胺可以与分布于肺部支气管的H1R和H2R结合发挥作用。H1R和H2R通过G蛋白偶联传递胞外信号到胞内，H1R可以促进核因子-κB （NF-κB）信号分子的表达，促进炎症反应［9］，H1R基因敲除小鼠气道炎症反应明显减弱［10］。有学者认为在不同的细胞发展阶段或者生理状态HR的水平可能不同［11］。本实验中，速发型哮喘模型组的H1R和H2R的表达都出现了明显的增加。模型组中，Zmu-1∶DHP品系H1R的表达量略高于DHP品系（P＞0.05），可能是Zmu-1∶DHP品系激发试验时气道更加敏感的重要原因。

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Histamine Receptor Expression and Their Effect on Pulmonary Function in Immediate Asthma Model of Two Guinea Pig Strains

WEI Zhen, LOU Hui-fang, WU Kai, CHEN Yan-hong, XIE Min, LIU Di-wen, XIE Qiang-min
（Laboratory Animal Center of ZheJiang University， HangZhou 310058， China）

ObjectiveTo establish immediate asthma model in two strains of guinea pigs （Zmu-1∶DHP and DHP） with ovalbumin （OVA）, and find out histamine receptor （H1R, H2R） gene expression difference and their effect on pulmonary function. MethodsTwo strains of Zmu-1∶DHP and DHP guinea pigs were divided into two model groups （MW and MP） and two control groups （BW and BP）respectively. Guinea pigs of model groups were sensitized with OVA, as control groups were treated with normal saline. on the first and 14th day, each guinea pig of model groups were given OVA. On the 28th day,dynamic lung compliance （Cdyn） and airwayresistance （Raw） of every guinea pig were recorded from 0 to 8 minutes after exposure to OVA. Then guinea pigs were sacrificed, lung tissue were examined by H1R, H2R mRNA expression test and immuohistochemistry （IHC） analysis. ResultsAfter exposure to OVA, guinea pigs of Zmu-1∶DHP and DHP model groups （MW and MP） had lower Cdynand higher Raw changes than control groups （BW and BP） from 0 to 8 minutes and with the maximum Cdyn and Raw change at third minute. Group BW had more sensitive reaction than Group BP. QPCR analysis revealed, group MW had higher mRNA expression of H1R and H2R than group BW （P＜0.05）. Obvious inflammatory cell infiltration of lung tissues were observed by HE staining in model groups （MW and MP）, but didn’t in control groups （BW and BP）. By IHC, the H1R and H2R expression were observed in smooth muscle of bronchus and vessel. ConclusionIn immediate asthma model, H1R and H2R express mainly in smooth muscle of bronchus, its sensitive may have high relation to expression of H1R.

Asthma； Ovalbumin （OVA）； Histamine receptor； Pulmonary function； Guinea pig

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0101-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.004

2015-12-08

浙江省公益性技术应用研究计划（2012C37085）

卫振（1982-）, 男, 硕士。研究方向, 实验动物模型与动物实验。E-mail：mudi001@126.com

刘迪文, 研究员。研究方向, 实验动物学。E-mail： liudiwen2004@163.com