K+、Mn2+对番茄果实中番茄红素积累及其关键酶基因表达的影响

王 艳，田红梅，张 建，王明霞，贾 利，方 凌

（安徽省农业科学院园艺研究所 合肥 230031）

番茄是全球最重要的蔬菜之一，番茄红素是决定番茄果实外观颜色的最主要的物质，同时还是重要的功能性营养物质，是目前自然界中发现的最强抗氧化剂，可有效地减少单线态氧和氧自由基对人体自身免疫系统的侵害。番茄果实在低温等条件下番茄红素合成受阻导致转色困难是生产上至今未攻克的难题。目前番茄红素的生物合成途径已基本清楚[1-2]，其中关键酶基因PSY和PDS已于1992年得到阐明[3-4]，对番茄植株生长过程中这2种基因表达的跟踪研究表明，在番茄果实发育过程中，PSY表达量增加了20倍，PDS表达增加量则少于3倍[5]。果实中番茄红素合成受诸多因素影响[6]。在前期的研究中，笔者初步探索了低温条件对番茄红素积累及其关键酶的影响[7]，本研究旨在前期研究的基础上继续探讨外源物质（K+、Mn2+）对番茄红素关键酶（PSY1、PSY2、PDS、ZDS）基因表达量的影响，为解决低温条件下番茄转色困难这一对生产造成严重影响的难题提供新的解决思路及途径。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为安徽省农业科学院园艺研究所培育的番茄高代稳定自交系‘T-CRH-13’。

1.2 方法

于2014年1月20日播种于安徽省农业科学院园艺研究所，穴盘育苗，3月22日定植，留3穗果打顶。从植株第一穗果果实膨大期开始，以清水为对照，浇施 240mg·L-1K2SO4（处理 1）、喷施0.1%MnSO4（处理2），每7 d处理1次，至果实膨大结束，采用随机区组处理，每处理设3个小区，每小区12株，分5个时期采样，根据果实成熟度标准在各小区随机采样，采样标准：第1个时期为青熟期，果顶泛白；第2个时期为转色期，果顶由白变红；第3个时期为半熟期，果实一半转色；第4个时期为坚熟期，整果着色，果实坚硬；第5个时期为完熟期，果实红熟变软（图1）。每处理每小区取3～4果，将整果果肉（含果皮）打碎后混合取样待测。

图1 果实转色的5个时期

采用分光光度计法和real-time实时荧光定量法测量果实转色的各个时期果实内番茄红素含量及PSY1、PSY2、PDS、ZDS的基因表达量。基因的相对定量分析采用ABI（Applied Biosystems）7500 Real Time PCR System进行，所用引物见表1，每个样品3次技术重复。以Actin作为内参基因，采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量，数据采用Excel进行分析。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 K+处理后果实番茄红素含量及合成途径中关键酶的变化

2.1.1 K+处理后番茄红素含量的动态变化 K+处理后果实中番茄红素含量均随果实成熟度增加而不断增加，与对照的番茄红素含量积累趋势相似，且K+处理下的番茄红素含量在果实发育的前2个时期积累缓慢，转色期后积累迅速，在果实进入完熟期之前，其番茄红素含量一直低于对照，至完熟期才明显高于对照。对照与处理番茄红素积累高峰期是一致的，均在转色期至坚熟期（图2）。

图2 K+处理后果实不同成熟期番茄红素含量的变化

2.1.2 K+处理后番茄红素关键酶基因表达量的动态变化 如图3所示，在完熟期之前，K+处理后果实不同成熟期的番茄红素关键酶PSY1、PSY2以及ZDS基因表达量均低于对照，其中PDS基因表达量在坚熟期始高于对照，完熟期时PSY1、PSY2、ZDS以及PDS基因表达量均高于对照，这与K+处理后番茄红素含量的积累规律是相似的，说明在果实完熟期之前K+可能通过某些作用抑制了这几种酶的基因表达从而影响了果实中番茄红素含量在这些阶段的积累，使得番茄红素含量低于对照，之后调控作用消失或者调控方向由负调控向正调控转化，从而使得番茄红素大量快速积累，至完熟期明显高于对照。

图3 K+处理后果实不同成熟期番茄红素关键酶基因表达量的动态变化

2.2 Mn2+处理后果实中番茄红素含量及其关键酶的动态监测

2.2.1 Mn2+处理后果实中番茄红素含量的动态变化

图4 Mn2+处理后果实不同成熟期番茄红素含量的变化

由图4可以看出，Mn2+处理后果实不同成熟期的番茄红素含量在整个果实转色过程中虽然是一直上升的，但均低于对照水平，这与有些文献中报道的试验结果不一致。对照条件下，番茄红素迅速积累及在转色期至坚熟期，而Mn2+处理下的番茄果实中番茄红素含量快速积累期在坚熟期至完熟期，这说明在本试验中，Mn2+处理后番茄红素积累的高峰期延迟，并且降低了番茄红素含量的整体水平。

2.2.2 Mn2+处理后果实的番茄红素关键酶基因表达量的动态变化 从图5可以看出，Mn2+处理后果实不同成熟期的各番茄红素关键酶基因表达量的变化规律不同。其中PSY2随转色程度的加深而逐渐升高，PSY1从青熟期至转色期有较大幅度的升高，之后有所下降，在半熟期后逐渐升高，转色期与完熟期2个时期的PSY1基因表达量差异不明显，Mn2+处理后的番茄果实其完熟期PSY1、PSY2的基因表达量均高于对照水平；而Mn2+处理后番茄果实中的PDS、ZDS基因表达量水平在5个转色时期均明显低于对照水平，这可能是造成其番茄红素含量低于对照水平的主要原因。

图5 Mn2+处理后果实不同成熟期番茄红素关键酶基因表达量的动态变化

3 讨论与结论

前人研究表明，K+与Mn2+处理可使果实中的番茄红素含量增加[8-10]。本试验发现，K+在调控果实中番茄红含量积累上起到了一定的作用，且在不同发育时期调控效果是不同的，在果实转色的前4个时期，番茄红素含量一直低于对照，即在转色前几个阶段，K+对番茄果实中番茄红素的积累并未起到促进作用，坚熟期至完熟期，正向调控作用才充分发挥出来，在番茄果实不同的转色阶段，K+发挥的调控作用是不同的，坚熟期之前是抑制了八氢番茄红素向番茄红素转化过程中PSY1、PSY2、ZDS以及PDS这些关键酶基因的表达而使得番茄红素含量减少，坚熟期之后这些关键酶基因的表达量有了快速的升高，从而番茄红素也大量积累，明显高于对照，这也说明了K+不仅参与了整个番茄红素合成途径的八氢番茄红素脱氢过程，而且参与了从八氢番茄红素合成六氢番茄红素，再脱饱和至ζ-胡萝卜素、链孢红素的过程中（图 6）[11-12]。

图6 番茄红素合成途径图

GGPS活性依赖PSY，Mn2+是决定GGPS用来合成类胡萝卜素还是其他类异戊二烯产物的关键调控因子，对番茄红素的合成至关重要。PSY是控制番茄红素合成的一个限速酶基因，控制着GGPP向八氢番茄红素的转化，PSY催化八氢番茄红素的形成依赖Mn2+[13]。本研究发现，Mn2+处理后的PSY基因表达量并不是在果实转色的每个时期都高于对照，而是在坚熟期后至完熟期高于对照，而其他2个酶PDS、ZDS基因表达量则一直低于对照，从而使番茄红素积累至完熟期仍低于对照，这与前人的研究中适宜浓度的锰肥叶面喷施可以提高番茄果实中的番茄红素含量的结论相异。

果实发育坚熟期至完熟期可通过K+调控而使该阶段的番茄红素含量迅速积累，在果实发育的不同阶段，K+所表现出的对番茄红素积累的不同调控方向，说明K+在番茄红素合成的过程中所起到的作用可能不仅仅是调控PSY1、PSY2、ZDS以及PDS这些酶，深入的调控机制有待进一步的试验探索；不同番茄材料对Mn2+的调控响应存在差异，是否与材料的基因型差异有关还需要进一步探索。