三七多糖对2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸信号通路的影响*

朱　双，胡凤霞黄石市中心医院，湖北 黄石435000

三七多糖对2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸信号通路的影响*

朱双，胡凤霞△
黄石市中心医院，湖北 黄石435000

目的：探讨三七多糖对2型糖尿病大鼠肝脏高同型半胱氨酸代谢信号通路3个关键分子亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）、胱硫醚β-合酶（CBS）、5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶（MTR）表达的影响。方法：将60只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组以及三七多糖治疗组，每组20只，模型组以及三七多糖治疗组给予高脂高糖饮食6个月建立2型糖尿病模型，模型建立成功后三七多糖治疗组给予三七多糖57mg/（kg·d）灌胃治疗，模型组给予同体积生理盐水灌胃，分别在治疗4周和8周后处死大鼠各半，收集血清和肝脏进行相关指标的检测。结果：治疗4周后大鼠血糖以及胰岛素抵抗指数三七多糖治疗组较模型组降低（P＜0.05），8周后进一步降低，胰岛素水平治疗4周后三七多糖治疗组较模型组降低（P＜0.05），8周后较4周无进一步改善；三七多糖治疗后，大鼠叶酸较模型组有一定升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），维生素B12在治疗4周后较模型组明显升高（P＜0.05），治疗8周后进一步升高；同型半胱氨酸在治疗4周后明显降低（P＜0.05），但在8周后无进一步改善；治疗4周后，与模型对照组比较，三七多糖治疗组MTHFR、MTR以及CBSmRNA及蛋白表达升高（P＜0.05），治疗8周后进一步升高，但未达到空白组水平。结论：三七多糖可显著降低模型大鼠血清中同型半胱氨酸含量，其可能是通过调控高同型半胱氨酸信号通路相关蛋白MTHFR、CBS、MTR的表达来实现。

2型糖尿病；亚甲基四氢叶酸还原酶；胱硫醚β-合酶；5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶；三七多糖

2型糖尿病是多种心脑血管病特别是冠状动脉粥样硬化、老年性痴呆、中风、静脉栓塞等心脑血管疾病的危险因素之一，而同型半胱氨酸是参与这一进程的关键因子，2型糖尿病患者多数伴有高同型半胱氨酸血症［1］。高同型半胱氨酸血症临床中是指患者血清中游离的以及和蛋白结合的同型半胱氨酸含量增高，而增高的关键是甲硫氨酸代谢异常。但是截止目前引起2型糖尿病血清同型半胱氨酸水平升高的原因尚不完全清楚，这可能与维生素B12及叶酸缺乏有关［2］。三七的作用在《本草求真》中曾描述为：专入肝胃、兼入心、大肠，又名山漆，或云能合金疮，如漆粘物也。三七多糖是从三七中提取的一类多糖类混合物，有文献报道［3］三七多糖具有较强的抗氧化能力。本研究拟用三七多糖干预2型糖尿病模型大鼠，分析其对血清中高同型半胱氨酸是否有降低作用，并分析其可能的机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物来源及分组雄性SD大鼠60只，体质量120～140 g，由武汉生物制品研究所提供，实验动物合格证号：SCXK(鄂)2010-0004，适应性喂养10天后随机分为3组各20只，空白组(只喂食普通饲料)，模型组(喂食高脂饲料+日常高脂饮食)，三七多糖组(喂食高脂饲料+日常高脂饮食)。

1.1.2药品与试剂三七多糖(西安天瑞生物技术有限公司)；高脂饲料(北京博泰宏达生物技术有限公司)，猪油以及红糖市场自购；叶酸、维生素B12以及葡萄糖试剂盒 (南京建成生物工程研究所)；胰岛素以及同型半胱氨酸试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)；琼脂糖(北京恒奥生物科技有限公司)；引物［生工生物(上海)股份有限公司］总RNA提取试剂盒(天根公司)，多克隆抗体MTHFR、CBS以及MTR，ECL发光试剂盒(美国Santa Cruz公司)；相应二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.12型糖尿病模型的建立及给药方法模型组以及三七多糖组，造模时间为6个月，造模成功后三七多糖组大鼠给予三七多糖52mg/(kg·d)灌胃，模型组给予同体积生理盐水灌胃，空白组无干预，分别于治疗4周和8周后处死大鼠各半，测定其相应指标。

1.2.2标本采集用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉大鼠，注射量为10mL/kg(体质量)，麻醉后绑定，无菌操作暴露腹腔，心脏迅速取血，血液提取后立即用3 000 r/min低温离心机离心10分钟，之后取血清，血清收集后立即置于-40℃保存，同时取出肝脏置于-40℃冰箱，备用。

1.2.3相关指标检测方法CHOL、TG、HDL-c、LDL-c以及葡萄糖的测定方法为酶法，胰岛素的检测方法为El isa法，具体的实验操作过程参照说明书进行。

1.2.4RT-PCR检测mRNA的表达随即称取肝脏组织30mg，立即用总RNA提取试剂盒提取总RNA，提取总RNA后立即取1μL进行定量，之后调平总RNA浓度，每组各取2μg逆转录cDNA，然后用逆转的cDNA为模板，PCR MasterMix试剂行PCR反应。反应条件为：98℃预变性2分钟，98℃变性10 s，48.6℃退火30 s，72℃延伸35 s，循环36次。将扩增后的产物行琼脂糖电泳，电泳完成后拍照采集图像，计算各条带的荧光强度值，以β-actin作为内参进行标准对照。每组重复实验3 次(引物设计参照文献进行［4］)。

MTHFR引物设计为：PrimerA：5′GAACGAGGCCAGAAGAAGT3′，

PrimerB：5′TTGAGCTGGCTGTGAACTTG3′，产物长度为571bps。

CBS引物设计为：PrimerA：5′AGTCTGGATCTCGCCTGATAC3′，

PrimerB：5′TGGTGGATAGGTGGTTCAAG3′，产物长度为412bps。

MTR引物设计为：PrimerA：5′CGCCTGCGGTAGGATTCT3′，

PrimerB：5′CTGACTATGGCCTCGAACAC3′，产物长度为460bps。

β-actin引物设计为：PrimerA：5′GTGACGGGCACCGCAAGAAGAG-3′，

PrimerB：5′ACGCACATTGCTGTGGAGAATTGGG-3′，产物长度为153bps。

1.2.5Western Blot检测相关蛋白的表达称取肝脏组织100mg用匀浆机匀碎，匀碎后立即用BCA试剂盒对蛋白进行定量，定量后每组各取样本50μg行SDS-PAGE电泳，所有实验过程全部按照标准的western blot法进行，在曝光洗片后扫描图像计算各条带的灰度值，以β-actin作为内参进行标准对照。每组重复实验3次。

1.3统计学方法数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以(±s)表示，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数三七多糖组干预4周时大鼠血糖、胰岛素以及胰岛素抵抗指数较模型组降低(P＜0.05)，8周时血糖和胰岛素抵抗指数进一步降低，但与治疗4周时比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.2叶酸、维生素B12、同型半胱氨酸三七多糖组干预后大鼠叶酸较模型组有一定升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)，维生素B12在治疗4周后较模型组明显升高(P＜0.05)，治疗8周后进一步升高；同型半胱氨酸在治疗4周后降低(P＜0.05)，但在8周后无进一步改善，见表2。

表1　干预后大鼠血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数变化情况χ±s）

表1　干预后大鼠血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数变化情况χ±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与空白组比较，P＜0.05。

组别　血糖/（mmol·L-1）　胰岛素/（μIU·mL-1）　胰岛素抵抗指数4周　8周　4周　8周　4周　8周空白组　5.32±1.13　5.84±1.07　2.70±1.26　3.05±1.32　0.64±0.09　0.79±0.13模型组　16.42±3.62#　16.49±4.08#　5.40±1.16#　5.62±1.24#　3.94±0.34#　4.11±0.17#三七多糖组　8.99±2.14*#　8.23±2.33*#　3.90±2.30*#　4.12±2.16*#　1.56±0.16*#　1.52±0.15*#

表2　干预后大鼠叶酸、维生素B12以及同型半胱氨酸变化情况χ±s）

表2　干预后大鼠叶酸、维生素B12以及同型半胱氨酸变化情况χ±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与空白组比较，P＜0.05。

组别　叶酸/（ng·mL-1）　维生素B12（pg·mL-1）　同型半胱氨酸/（μmol·mL-1）4周　8周　4周　8周　4周　8周空白组　5.99±0.45　6.23±0.64　678.4±100.8　667.5±121.4　5.41±0.36　5.43±0.27模型组　5.13±1.29#5.36±1.07#　477.6±121.4#　468.7±142.3#　16.58±4.11#　17.08±4.09#三七多糖组　5.47±1.03　5.89±0.78　553.2±99.6*#　589.4±125.6*#　8.43±1.36*#　8.51±2.15*#

2.3MTHFR、CBS、MTR的mRNA表达干预4周后，与模型组比较，三七多糖组MTHFR、MTR以及CBSmRNA表达明显升高(P＜0.05)，治疗8周后进一步升高，但未达到空白组的水平，见图1—2。

图1　干预4周后大鼠肝脏提取液MTHFR、CBS和MTRmRNA表达

图2　干预8周后大鼠肝脏提取液MTHFR、CBS和MTR蛋白表达

2.4 MTHFR、CBS、MTR三种酶的蛋白表达干预4周后，与模型组比较，三七多糖组MTHFR、MTR以及CBS蛋白表达明显升高(P＜0.05)，治疗8周后进一步升高，但仍未达到空白组的水平，见图3—4。

图3　干预4周后大鼠肝脏提取液MTHFR、CBS和MTRmRNA表达

图4　干预8周后大鼠肝脏提取液MTHFR、CBS和MTR蛋白表达

3　讨论

近年来随着人们生活水平的提高，2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mel l itus，T2DM)的发生率越来越高［5］。有研究显示［6］，当前我国已经成为糖尿病大国，而其中95%为2型糖尿病，T2DM严重威胁着人们健康，特别相关并发症危险更甚，而血清中同型半胱氨酸含量增加是导致心脑血管病的危险因素。因此，有学者提出，控制2型糖尿病，目前最为关键的可能是控制血清中的同型半胱氨酸含量，而当前控制同型半胱氨酸升高的主要药物为维生素B12和叶酸，但维生素B12和叶酸并没有降糖作用，关于其他多糖类既有降糖作用也能降低同型半胱氨酸水平的研究偶有报道［6］。三七多糖为中药三七的提取物，本研究采用三七多糖干预2型糖尿病模型大鼠，观察大鼠血糖以及血清中同型半胱氨酸的变化，以期为临床药物治疗2型糖尿病提供帮助。

同型半胱氨酸信号通路主要由MTHFR、CBS以及MTR三个酶蛋白构成，这三个酶蛋白构成了同型半胱氨酸转化的2条途径，途径一为在MTHFR的催化下，血清中的四氢叶酸可由在肝细胞中发生甲基化，生成N5-甲基四氢叶酸，此时，在MTR酶的催化下，N5-甲基四氢叶酸作为同型半胱氨酸供体提供给同型半胱氨酸甲基，最终促进同型半胱氨酸合成蛋氨酸；第二条途径为在CBS的催化下，同型半胱氨酸与血清中游离的丝氨酸发生反应，进而缩合生成胱硫醚，胱硫醚再进一步转化为可经尿排除的物质排出体外［7-9］。近年来，2型糖尿病患者如何控制血清中的同型半胱氨酸受到越来越多学者的关注［10-12］。

本次研究采用三七多糖干预2型糖尿病大鼠，结果显示干预4周后大鼠血糖以及胰岛素抵抗指数三七多糖组较模型组降低(P＜0.05)，8周后进一步降低，胰岛素水平治疗4周后三七多糖组较模型组降低(P＜0.05)，8周后较4周进一步改善；提示三七多糖可明显降低血糖和胰岛素抵抗指数，但对胰岛素改善效果较差。三七多糖干预后大鼠叶酸较模型组有一定升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)，维生素B12在干预4周后较模型组升高(P＜0.05)，治疗8周后进一步升高；同型半胱氨酸在干预4周后降低(P＜0.05)，但在8周后未进一步改善；提示三七多糖可短时间内改善并长时间维持血清中同型半胱氨酸含量；干预4周后与模型组比较，三七多糖组MTHFR、MTR、CBSmRNA及蛋白表达升高(P＜0.05)，治疗8周后进一步升高，但仍然未达到空白组水平。三七多糖可调节同型半胱氨酸代谢的3个关键酶MTHFR、CBS以及MTR mRNA和蛋白的表达。

综上所述，三七多糖可显著降低血清中同型半胱氨酸含量，其可能是通过调控高同型半胱氨酸信号通路相关蛋白MTHFR、CBS、MTR的表达来实现。

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The EffectsofPanax Polysaccharide on Hom ocysteine Signaling Pathway of the Ratsw ith Type Two D iabetesMellitus

ZHU Shuang，HU Fengxia△
HuangshiMunicipality Central Hospital，Huangshi435000，China

Objective：To explore the influence of panax polysaccharide on the expressions of three key molecules MTHFR，CBS，MTR of homocysteine signaling pathway of the rats w ith type two diabetesmellitus （T2DM）.Methods：Sixty rats were randomized into the blank group，themodel group and the treatment group of panax polysaccharide，20 rats each group，themodel group and the treatment group of panax polysaccharidewere given high fatand high sugar diet for six months to establish T2DM ratmodels，after successfully establishing the models，the treatmentgroup of panax polysaccharide accepted intragastric administration of panax polysaccharide in the concentrations of 57mg/（kg·d），themodelgroup received physiologicalsaline in the same volume，the ratswere sacrificed after treating in fourweeksand eightweeks respectively，the related indexeswere detected after collecting the serum and liver.Results：Blood glucose and insulin resistance index of the treatment group of panax polysaccharide decreased obviously compared w ith themodel group after treating in fourweeks（P＜0.05），these indexes lowered after treating in eightweeks，insulin level decreased after treating in fourweekswhen the treatment group of panax polysaccharidewas compared w ith themodelgroup notably（P＜0.05），therewasno improvements after treating in eightweeks compared with these in fourweeks；after treatingw ith panax polysaccharide，the levels of folic acid of the rats rose compared w ith themodel group，but there was no statisticalmeaning（P＞0.05），the levelsof vitamin B12improved comparedwith themodelgroup after treating in fourweeks（P＜0.05），they improved furtheraftertreatingineightweeks；the levelofhemocysteinedecreasedobviouslyaftertreating in fourweeks（P＜0.05），while therewasno improvements after treating in eightweeks；compared w ith themodelgroup after treating in four weeks，mRNA and protein expressions of MTHFR，MTR and CBS rose evidently in the treatment group of panax polysaccharide（P＜0.05），theseexpressions improved after treating in eightweeks，but they didn’t reach the levelof the blank group.Conclusion：Panax polysaccharide could notably decrease the contents of homocysteine in the rat model apparently，whichmight be realized by regulating the expressions of MTHFR，MTR and CBS in homocysteine signaling pathway.

type two diabetesmellitus；MTHFR；CBS；MTR；panax polysaccharide

R587

A

1004-6852（2016）07-0015-04

2015-10-15

湖北省科技厅资助项目（编号2012FFA016）。

朱双（1776—），女，主管护师。研究方向：糖尿病的护理。

胡凤霞（1972—），女，副主任护师。研究方向：慢性肾脏病及血透、糖尿病的护理。