荧光染色法与KOH湿片法在真菌直接镜检中的应用比较

韩德忞　刘原志　朱均昊　李莉　章强强

(复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室，上海 200040)



·技术与方法·

荧光染色法与KOH湿片法在真菌直接镜检中的应用比较

韩德忞刘原志朱均昊李莉章强强

(复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室，上海 200040)

目的探索一种结果更可靠的真菌直接镜检方法。方法对600例临床高度疑似真菌感染的标本分别采用荧光染色法和KOH湿片法进行真菌直接镜检。结果荧光染色法和KOH湿片法的真菌检出率分别为97%和88.5%。结论 荧光染色法是一种适合临床的、快速有效的真菌镜检方法。

KOH湿片法；真菌直接镜检；真菌荧光染色法；真菌感染

[Chin J Mycol，2016，11(4):240-242]

直接镜检法旨在通过显微镜和简单的试剂(通常1种)的帮助观察标本中的真菌结构。在真菌实验室中常规采用KOH湿片法观察标本中有无真菌有形成分，本实验采用荧光染色法与KOH湿片法分别对同一标本同时作镜检，比较两种方法在镜下的真菌形态的辨别清晰度与敏感性。

1　材料和方法

1.1荧光染色液的成分与染色原理

荧光染色液的成分我们采用的莱芙特敏真菌荧光染色液配有荧光染色A液及染色B液。其中荧光染色A液是一种含有特殊荧光素标联的几丁质酶的复合溶液，其中添加了浓度为10%的氢氧化钾有助于溶解皮屑及甲屑标本中的角质细胞。染色B液是一种含有伊文思蓝染料的溶液，用于去除视野中杂质荧光的干扰。

染色原理一般细胞荧光素会与各类标本中真菌细胞壁的(1,3)-β-D葡聚糖结合，从而通过荧光标记进行真菌检测。本法利用一种重组几丁质酶来检测人体组织内是否存在真菌感染的方法。几丁质存在于绝大多数真菌的细胞壁中，它是一种(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖均聚物。真菌荧光染色液中的重组几丁质酶克隆自副溶血性弧菌，该重组酶可特异性地紧密结合到几丁质上。特殊荧光素标联的真菌酶可以作为组织化学标记物，在荧光显微镜下用来检测各种组织样本中的真菌细胞壁。特殊荧光素标联的几丁质酶可以高亲和力与真菌细胞壁上的几丁质结合，在一般的实验条件下，不会被破坏。

1.2真菌荧光染色的适用范围及存储

该荧光染色液能够与各类真菌(霉菌及酵母)细胞壁中的几丁质结合从而产生荧光标记，包含皮肤癣菌、马拉色菌、念珠菌、曲霉及各类变异的菌丝结构。适用于皮屑、甲屑、毛发、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各种标本。荧光染色液可以室温避光保存。

1.3标本来源

标本来自于华山医院皮肤科门诊及病房住院患者，临床高度疑似真菌感染，共600例。其中皮屑标本中手足部位262份，体股部位52份，甲屑标本76份，毛发标本10份，深部标本包括痰液112份，尿液64份，胸水及其他体液标本24份。同时用2种方法检测。

1.4方法

取材①深部标本：a.痰液标本取自患者清晨漱口后的第1口晨痰，标本存入无菌痰液容器中保存。b.尿液标本取自患者的早上的第1次清洁尿，使用无菌容器收集保存，离心后取沉渣作镜检。c.胸水及其他体液标本需要无菌采集于无菌试管中，离心后取沉渣作镜检。②浅部标本：a.皮屑：75%乙醇消毒患者皮损部位，使用钝头刀片刮取皮损炎性活动性边缘的鳞屑，将标本直接置于载玻片上。b.毛发：75%乙醇消毒局部，使用镊子拔取病发直接置于载玻片上。c.甲屑：75%乙醇消毒后，刮取甲下碎屑，直接置于载玻片上。

KOH湿片法采集各种标本于载波片上，滴加10%KOH溶液1滴，覆上盖玻片，微加热后轻压盖玻片使标本溶解后，置显微镜下观察。尿液及胸水不加KOH。

荧光染色法将各种标本采集后置载玻片上，滴加1滴荧光染色A液，使标本与染液充分混匀作用1 min，甲屑标本需要延长至3 min，使其完全溶解，再滴加1滴染色B液，可使用竹签混匀两液，复染1 min后覆上盖玻片，用滤纸吸取多余溢出的染液，轻压盖玻片后在荧光显微镜(型号Mshot SHHW-001)下低倍镜观察，查见荧光标记的菌丝或孢子后作高倍镜证实。

2　结　　果

对600例患者的标本分别同时采用荧光染色法和KOH湿片法检测，结果显示荧光染色法对各种标本中的皮肤癣菌、念珠菌及马拉色菌的荧光标记非常清晰(见图1～4)，易于识别。荧光染色法与KOH湿片法的阳性率分别为97%及88.5%，统计学卡方检测显示x2=8.67，P<0.05，差异有统计学意义，对比试验显示同一标本采用荧光染色法较KOH湿片法阳性率为高。具体结果见表1。

图1痰标本：荧光染色，念珠菌孢子出芽(×400)图2皮屑标本：荧光染色，大量的皮肤癣菌细长菌丝(×400)图3皮屑标本：荧光染色，马拉色菌短粗菌丝(×400)图4皮屑标本：荧光染色，念珠菌菌丝(×400)

Fig.1Sputum sample:fluorescent staining,Candida spore germination(×400)Fig.2Dander sample:fluorescent staining,a large number of elongated dermatophytes hyphae(×400)Fig.3 Dander sample:fluorescent staining,Malassezia tubby hyphae(×400)Fig.4Dander sample:fluorescent staining,Candida hyphae(×400)

3　讨　　论

KOH湿片法制作方法简单便捷，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，但非常依赖于检验人员的经验与技术水平，且由于标本中常含有各种杂质导致视野背景较杂乱，影响真菌的检出，其中甲屑标本最为明显，KOH湿片法短时间无法溶解标本中的杂质，一定程度上干扰了真菌检出，导致阳性率不高。

真菌荧光染色法通过特殊荧光素标联的几丁质酶与真菌细胞壁中的几丁质产生特异性的结合，并吸收紫外光(波长340～380 nm)，使菌丝及孢子发出明亮的蓝色荧光，在荧光显微镜下真菌轮廓和黑暗背景可形成明显反差，易于在镜下寻找及识别，其真菌的形态结构相对于KOH湿片法更为清晰，真菌荧光染色液A液中含有10%的KOH成分，能够溶解皮屑、甲屑标本中的角质细胞及其他杂质。真菌荧光染色可通过反复染色使因放置时间过长而使荧光减少的样本恢复荧光，也可通过重复染色步骤大幅减少背景荧光，使菌丝与孢子更为明显。相对于KOH湿片法，虽然荧光染色法的操作需要增加一步染色步骤，且需要荧光显微镜，但其对于标本中菌丝、孢子由于荧光的标记使得寻找相对容易，也便于识别，真菌菌丝、孢子清晰显现，检测灵敏度大幅提高。特别是在KOH湿片法中孢子与脂肪滴有时很难鉴别，而荧光染色法对脂肪滴不产生标记，易于鉴别，且特异性高，其能使少量真菌着染，弥补了传统的KOH湿片法在真菌数量少时检出率不高的不足，并且染色时间短，只需2 min，结果直观。根据我们的数据统计与经验，荧光染色法在浅部标本与深部标本的检测中，与KOH湿片法比较具有较大的优势，KOH湿片法因片中杂质多，背景杂乱，标本中的散在菌丝或孢子难以寻找辨认，存在着主观判断的误差，易漏检的局限性，而使用荧光染色能快速有效的找到标本中的菌丝或孢子，并且结构清晰，明显地提高了标本的阳性率。以往的文献[1-7]已证实荧光染色法在真菌检测中较传统的KOH湿片法具有敏感性强，阳性率高的特点。

表1各种标本荧光染色法与KOH湿片法检测真菌的阳性率比较

Tab.1Comparison of the positive rates of various specimens in fungal detection between fluorescent staining and KOH

标本来源(例)荧光染色法KOH湿片法阳性(%)阴性(%)阳性(%)阴性(%)皮屑(314)318(98.09%)6(1.91%)283(90.13%)31(9.87%)甲屑(76)69(90.79%)7(9.21%)57(75%)19(25%)毛发(10)10(100%)0(0%)7(70%)3(30%)痰(112)107(96.42%)5(3.58%)102(91%)10(9%)尿(64)63(98.4%)1(1.6%)61(95.31%)3(4.69%)胸水及其他体液(24)24(100%)0(0%)21(87.5%)3(12.5%)合计(600)581(97%)19(3%)531(88.5%)69(11.5%)

所以，荧光染色法不失为一种快速有效检测真菌的新方法。莱芙特敏荧光染色液性质稳定，常温下可保存2 a以上，但应避光保存，否则影响染色效果。

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[本文编辑]卫凤莲

Comparison of novel fluorescent staining and KOH microscopic examination in fungal measured by direct microscopy

HAN De-min,LIU Yuan-zhi,ZHU Jun-hao,LI Li,ZHANG Qiang-qiang

(The Lab of Medical Mycology,Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040)

ObjectiveTo explore a reliable and rapid method in direct microscopic examination for fungi using novel fungal fluorescent staining.MethodsSamples from 600 clinically suspected cases of fungal infection were screened by fluorescent staining and KOH microscopic examination.ResultsFungal elements were detected in 97% of the cases by fluorescent staining and 88.5% by KOH.ConclusionsFluorescent staining is a reliable and effective method for fungi microscopic examination.

KOH；fungal direct microscopy；fungal fluorescent staining；fungal infections

国家自然科学基金(81573056)

韩德忞，男(汉族)，大专，技师.E-mail:sarekes@126.com

章强强,E-mail:zhangqq8@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0240-03

2015-07-27