离子色谱法测定牛奶中硫氰酸根方法的应用及优化

冯云

（江苏省产品质量监督检验研究院，江苏南京210007）

离子色谱法测定牛奶中硫氰酸根方法的应用及优化

冯云*

（江苏省产品质量监督检验研究院，江苏南京210007）

基于离子色谱测定牛奶中硫氰酸根的方法，通过对相关试验条件进行优化，进一步证实了牛奶样品中含有硫氰酸根的乳过氧化物酶体系具有防腐保鲜的作用。该方法可以简单、快速、准确地应用于牛奶中硫氰酸根的测定。

离子色谱法；硫氰酸根；乳过氧化物酶体系

1 前言

论述牛奶样品添加硫氰酸必要性及现状等。

本试验通过对牛奶样品直接添加硫氰酸钠，并将样品保存在恒温恒湿的环境中，然后经过1、2、4、8、12、16、24、48h和72h的时间间隔后，分别测定牛奶样品中硫氰酸根的本底含量以及经过这些时间间隔之后的硫氰酸根的含量，从而判断在代谢体系中硫氰酸根的含量是否受到影响。［1］

2 实验部分

2.1 主要试剂

试验所用试剂及其生产厂家见表1。

表1 试验所用试剂及其生产厂家

2.2 试验仪器

试验所用仪器及其生产厂家见表2。

表2 试验所用仪器及其生产厂家

2.3 实验原理

试验样品经直接添加硫氰酸钠模拟硫氰酸根环境后，将其保存在恒温恒湿的环境条件下，经过一段代谢时间之后，对牛奶样品中硫氰酸根的本底含量以及代谢后的含量进行测定。首先称取液体乳制品4～5g于25mL比色管中，加入乙腈5mL左右至10mL刻度线，剧烈振荡，超声萃取10min后，于4℃冰箱内静置10min来沉淀蛋白。吸取上清液1mL于10mL比色管中，用水定容至10mL摇匀，将稀释后的溶液经过RP柱和0.22μm滤膜，滤液进小瓶后待上机分析。

2.4 试验方法的优化

2.4.1 样品准备

直接将液体奶样品（鲜牛乳、酸牛乳等）称量4～5g到25mL的比色管中；对于乳粉等固体样品，称取适当样品，加入适量水混匀制成复原乳再称取样品；对于奶酪、奶油等半固体样品，称取适量样品，加入海砂，研磨混匀再称取样品。注意此时不要将奶样品碰触到10mL刻度线以上的管壁上，防止添加乙腈后管壁上的蛋白沉淀不下来，影响试验结果。

2.4.2 沉淀蛋白

生鲜奶中含有丰富的蛋白质，测定前必须将其去除，否则会造成色谱柱污染。用滴管直接将乙腈液体添加到比色管中，此时奶样品∶乙腈的比值大约在5∶5，剧烈震荡，在超声波清洗机里放置10min，目的是为了彻底混合均匀牛奶样品和沉淀剂乙腈，最大作用地发挥蛋白沉淀剂的功能。然后在4℃的冰箱里放置10min来沉淀蛋白，因为在低温条件下蛋白沉淀效果明显优于常温条件。蛋白沉降效果优于常温条件，两者沉降的结果对回收率没有显著影响，沉降时间以10min为优［2］。

图1 超声提取样品效果图

对于硫氰酸盐的提取，曾采用过直接震荡提取的方法，但是提取效果明显没有超声提取10min快速高效，超声5、10、20、30min和40min对提取结果的影响见图1，图1表明超声10min提取样品结果较好。

在这个去杂过程中，也有通过添加无机沉淀剂来完成的，如常用的醋酸锌+亚铁氰化钾，但是此方法会在测定体系中带入金属离子，并对提取结果的稳定性有影响；而若加入有机沉淀剂如乙醇，沉淀效果不佳。

2.4.3 固相萃取

从冰箱内将样品取出来，此时可以看到明显的上清液分层，准确抽取1mL上清液到10mL比色管中，定容到线，此时上清液即被稀释了10倍（若在此过程中发现上清液过少，分层不明显，可以用离心机离心之后再抽取1mL的上清液）。此时就可以准备用全自动固相萃取仪来除去脂肪等大分子物质，全自动固相萃取小柱是ON GUARRP（2.5mL），或相当者（如C18），使用前依次用5mL甲醇和10mL水进行活化，最后获得6mL萃取后的样品溶液。

2.4.4 过膜进样

用针管吸取固相萃取后的样品过0.22μm的聚醚砜水相针式滤膜，进入走样小瓶，等待上机走样分析。

2.5 标准系列的配置

称取1mL的硫氰酸根母液，即硫氰酸根离子标液（1 000mg/L），置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度线，此溶液含硫氰酸10mg/L，此溶液为标准中间液。

分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 和3.0mL硫氰酸根标准中间液，用水定容到10mL容量瓶中，此时硫氰酸根的浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/L和3.0mL/L。此溶液使用时现配。

2.6 色谱条件

色谱分析条件见表3。

3 结果与讨论

3.1 代谢体系中硫氰酸根含量变化规律

根据文献报道，乳过氧化物酶体系由三部分组成：乳过氧化物酶（LP）、硫氰酸根（SCN-）、过氧化氢（H2O2），只有在这三种成分都存在的情况下，乳过氧化物酶体系才具有活性。乳过氧化酶体系的反应机制是根据H2O2浓度的不同和是否存在外源电子供体而不同的。其中，SCN-通过与过氧化等效的2个电子直接传递给过氧化酶与H2O2反应的产物而被氧化，产生短暂存在的OSCN-中间氧化产物，其可杀死或抑制很多微生物的生长和代谢；另外，LP能催化I-、SCN-和一定浓度Br-，但不能使Cl-氧化，因为Cl-不能作为LP的底物，而SCN-可作为生理上的酶底物。因此，试验创新性地设计了一定的时间梯度，来检测经过一段的代谢时间之后，牛奶中的硫氰酸根是否存在代谢消耗的现象，从而验证含有硫氰酸根的牛奶是否确实存在一定的保鲜作用。实验结果如图2所示。

表3 色谱分析条件

从图2可以看出，代谢初始，硫氰酸根的含量是明显减少的，当减少到一定的含量范围后就逐渐趋于平衡，含量逐渐稳定下来，趋于一个固定的含量值。

图2 代谢体系中硫氰酸根的含量变化

由图2可以看出，硫氰酸根的含量随时间延长在逐渐减少。

3.2 代谢体系中牛乳酸度变化规律

牛奶在存放过程中由于微生物的活动，分解乳糖为乳酸，使牛奶的酸度增高。牛奶的酸度越高，说明牛奶受微生物污染的程度越严重。因此，可以通过测定牛奶的酸度评价牛奶的新鲜度，查看保鲜效果。具体结果参看图3。

图3 牛乳酸度的测定

3.3 代谢体系中硫氰酸根含量与牛乳酸度关系

为了验证硫氰酸根的减少是否真的用于乳过氧化物酶体系中来达到防腐的作用，可以通过测量牛奶的酸度值来验证，图3可以看出，随着硫氰酸根含量的增加，在相同代谢时间后的牛奶算酸度是不同的，硫氰酸根的含量越多，牛奶酸度相对越低，得出了硫氰酸根确实可以减慢牛奶的腐败速度的结论。所以，目前乳过氧化物酶体系在食品工业中得到了广泛的应用，主要是在乳品工业中用于原乳的储存和运输，在食品行业的发展前景是非常巨大的。

4 结语

试验采用离子色谱直接测量牛奶中的硫氰酸根，检测条件稳定，加标回收率较高，变异系数较小，重复性好，检出限低。整个方法准确可靠，灵敏度较高，可操作性强，应用简单方便。其对质检部门开展乳制品硫氰酸根残留检验，打击非法添加行为具有现实参考价值，对生鲜乳硫氰酸根国家限量标准的制定具有重要意义。

Application and Optimization of Ion Chromatography for Determination of Thiocyanate in Milk

Feng Yun
(Jiangsu Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Jiangsu Nanjing 210007)

Based on ion chromatography for the determination of milk thiocyanate method, through the optimization of the test conditions, it further confirmed that the milk sample contains the root of the sulfur acid in the root of the oxide enzyme system had the role of anti-corrosion. This method is simple, rapid and accurate for the determination of thiocyanide.

Ion chromatography; Thiocyanide; Lactoperoxidase system

TS255

A

2096-0387（2016）04-0016-03

冯云（1985-）女，湖南衡阳人，本科，助理工程师，研究方向：食品安全

[1]潘丙珍,刘青,庞世琦,等.离子色谱法测定酒中的有机酸和无机阴离子[J].现代食品科技,2013,29(4):876-880.

[2]张磊,周光明,熊建飞.离子色谱法测定水果和果酱中的3种糖[J].食品科技,2013,39(3):259-263.