茶壳中原花青素的抗氧化活性研究

熊伟，曾梅花，韩晓丹，徐国良，袁菊如，邓朝阳

（1. 江西省科学院应用化学研究所，江西 南昌，330096；2. 江西出入境检验检疫局，江西南昌 330002）

茶壳中原花青素的抗氧化活性研究

熊伟1，曾梅花2，韩晓丹1，徐国良1，袁菊如1，邓朝阳1

（1. 江西省科学院应用化学研究所，江西 南昌，330096；2. 江西出入境检验检疫局，江西南昌 330002）

以茶壳为原料，提取分离其中的原花青素，并研究其抗氧化活性。实验结果表明：原花青素对DPPH自由基、羟基自由基（·O H）、超氧阴离子自由基（O2-·）具有较强的清除作用；通过还原力和总抗氧化活性的测定，证明原花青素的抗氧化能力略高于抗氧化剂BHT。

茶壳；原花青素；自由基；抗氧化活性

原花青素是具有C6-C3-C6结构的黄烷醇及其聚合体，在结构上是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成［1-2］。它具有很强的生物活性，能清除人体内过剩自由基，提高人体免疫力，具有很强的抗氧化能力，可作为防癌、抗突变、防治心血管疾病药物的主要有效成分和用作安全无毒的新型抗氧化剂［3］。

目前，原花青素主要从葡萄籽中获得［4-5］，而从茶壳中提取分离的研究报道较少。茶壳是油茶去仁后留下的外种皮［6］，目前茶壳一般被废弃，仅有少部分作为燃料、培养食用菌以及用于制造活性碳等物质［7-8］。 本研究以茶壳中提取分离的原花青素为研究对象，通过自由基清除、还原力和总抗氧化活性的测定，并与传统抗氧化剂BHT对比，研究其抗氧化性能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶壳（采自江西上饶，60℃干燥24h备用）；原花青素对照品（天津市尖峰天然产物研究开发有限公司）；SOD试剂盒（南京建成科技有限公司）；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、硫酸亚铁、水杨酸、钼酸胺、磷酸钠、无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁等（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外分光光度计（北京普析科学仪器有限责任公司）；RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化科技有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；JM-10002天平（余姚市纪铭称重校验设备公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 茶壳中原花青素的提取分离实验

采用课题组自有专利技术提取分离茶壳中的原花青素［9］，具体方法为：准确称取一定量干燥后的茶壳，粉碎至60目过筛，采用乙醇浸提其中的原花青素：提取温度为70℃，提取时间为120 min，乙醇浓度为65%，液料比为20ml/g，提取完毕后浓缩提取液备用。采用大孔树脂S-8对提取液进行吸附，调节上柱液中原花青素的浓度为1.5mg/ml，pH值为6，吸附流速为1.5BV/h，吸附完毕后采用30%乙醇进行洗脱，洗脱液浓缩干燥后得到原花青素样品备用，经检测其纯度达到75%以上。

1.3.2 原花青素抗氧化性能的测定

通过对制备的原花青素样品进行DPPH自由基、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）清除，还原力以及总抗氧化活性实验，并与传统抗氧化剂BHT进行对比，从而对原花青素的抗氧化性能进行全面、客观的评价。

1.3.2.1 原花青素对DPPH自由基的清除作用

采用DPPH分光光度法测定原花青素对DPPH自由基的清除作用［10］。具体方法为：称取一定量的原花青素，配置成不同浓度的溶液 （5、10、20、40、60、80、100ug/ml）。精密吸取2ml不同浓度的样品溶液，分别加入0.1 mmoL/L DPPH无水乙醇溶液2mL，摇匀后于40℃恒温避光静置30min，于517nm波长处测定样品吸光度，BHT做为阳性对照。自由基清除率按下列公式计算：

注：A0：不加样品时的吸光度值；A1：加入样品溶液后的吸光度值；A2：不加DPPH时样品本身的吸光度值。

1.3.2.2 原花青素对羟基自由基（·OH）的清除作用

采用水杨酸法测定原花青素对羟基自由基（·OH）的清除作用［11］。具体方法为：精密吸取不同浓度的样品溶液1 mL（50、100、200、400、600、800、1 000ug/ml），分别加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液和1.5mL水杨酸-乙醇溶液，然后加入0.1 mL 0.03%H2O2，于37 ℃反应0.5 h后放入离心机，以3000 r/min的速度离心10 min，于510 nm处测定吸光度， BHT做为阳性对照。羟基自由基（·OH）清除率按下列公式计算：

注：A0：不加样品时的吸光度值；A1：加入样品溶液后的吸光度值；A2：不加H2O2时的样品本身的吸光度值。

1.3.2.3 原花青素对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用

采用黄嘌呤氧化酶法，参照SOD试剂盒的方法进行测定［12］。具体方法为：将样品配制成不同浓度的溶液（50、100、200、400、600、800、1 000ug/ml），按照试剂盒的方法进行测定，BHT做为阳性对照。按下列公式计算样品对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率：

注：A0为空白管的吸光度值， A1为样品管的吸光度值。

1.3.2.4 原花青素还原力的测定

采用普鲁士蓝法测定原花青素的还原力［13］。具体方法为：分别取1ml不同质量浓度的样品溶液（50、100、200、400、600、800、1000ug/ml），依次加入2.5mL、0.2mol/L PBS缓冲液（ pH6.6）和2.5mL、1%铁氰化钾于50 ℃水浴中保温20min后快速冷却，再加入2.5mL、10%三氯乙酸溶液，以3000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水，2.5mL，0.1% 三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度值， BHT做为阳性对照，吸光度值越高还原力越强。

1.3.2.5 原花青素总抗氧化活性的测定

采用Prieto法测定原花青素的总抗氧化活性［14］。具体方法为：在试管中依次加入3 mol/L H2S04溶液1m1，0.14mol/L Na3P04溶液1m1和0.02 mol/L钼酸铵溶液1 ml，再加入1ml不同质量浓度的样品溶液（50、100、200、400、600、800、1 000ug/ml），蒸馏水定容至5 ml，加塞摇匀，在95℃水浴中加热90 min，取出冷却后在695nm波长下测定吸光度，吸光度值越高总抗氧化活性越强。以不加样品作为空白对照，BHT做为阳性对照，

2 结果与分析

2.1 原花青素对DPPH自由基的清除作用

原花青素对DPPH自由基清除率的影响见图1。由图1可知，随着原花青素质量浓度的增加， DPPH自由基的清除能力也逐渐增强，当原花青素质量浓度达到60 ug/ml以上时，清除率基本趋于平衡。这可能是由于原花青素质量浓度越高，其作为自由基的接受体阻碍自由基连锁反应的能力也就越强，因而DPPH自由基的清除能力也越强。与抗氧化剂BHT相比，在5-40ug/ml范围内，原花青素对DPPH自由基的清除率略低于BHT，在40-100 ug/ml范围内，原花青素对DPPH自由基的清除率略高于BHT。

图1 原花青素对DPPH自由基清除率的影响

2.2 原花青素对羟基自由基（·OH）的清除作用

原花青素对羟基自由基（·OH）清除率的影响见图2。由图2可知，随着原花青素质量浓度的增加，羟基自由基的清除率表现出逐渐增大的趋势。总体而言，原花青素对羟基自由基（·OH）的清除效果要明显强于BHT。

2.3 原花青素对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除作用

图2 原花青素对羟基自由基（·OH）清除率的影响

原花青素对超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的影响见图3。由图3可知，随着原花青素质量浓度的增加，超氧阴离子自由基的清除能力也逐渐增强，当浓度达到800 ug/ml时，清除率基本保持不变。与抗氧化剂BHT相比，在50-600ug/ml范围内，原花青素对超氧阴离子自由基（O2-·）的清除率略低于BHT，在800-1 000 ug/ml范围内，原花青素与BHT基本接近。

图3 原花青素对超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的影响

2.4 原花青素还原力的测定

原花青素还原力的测定见图4。由图4可知，随着原花青素质量浓度的不断增加，原花青素的还原力也不断增强。在50-600ug/ml范围内，增长速度较快，几乎呈直线增长。当浓度达到600 ug/ml以后，增长速度有所减缓。与抗氧化剂BHT相比，原花青素的还原力略高于BHT。

图4 原花青素的还原力

2.5 原花青素总抗氧化活性的测定

原花青素总抗氧化活性的测定见图5。由图5可知，随着原花青素质量浓度的增加，原花青素的总抗氧化活性不断增强，并表现出与还原力相近的趋势。与抗氧化剂BHT相比，原花青素的总抗氧化活性略高于BHT。

图5 原花青素的总抗氧化活性

3 结论

实验结果表明：茶壳中提取的原花青素对DPPH自由基、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·）具有较强的清除作用；通过还原力和总抗氧化活性的测定，证明原花青素的抗氧化活性略高于抗氧化剂BHT。因此，茶壳中提取的原花青素具有较强的抗氧化能力，作为天然抗氧化剂具有良好的开发前景。

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Study on antioxidative activity of procyanidin from episperm of tea seeds

Xiong Wei1，Zeng Mei-hua2，Han Xiao-dan1，Xu Guo-liang1，Yuan Ju-ru1，Deng Zhao-yang1
(1. Institute of Applied Chemistry，Jiangxi Academy of Sciences，Jiangxi Nanchang 330096 PRC ; 2.Jiang Xi entry-exit inspection and quarantine bureau of PRC，Jiangxi Nanchang 330002 PRC）

In this paper, the procyanidin was extracted from episperm of tea seeds and antioxidative activity was researched. The results indicated that procyanidin had strong scavenging effect to DPPH, hydroxyl and superoxide radical ; The antioxidant activity of procyanidin was slightly higher than BHT by the determination of reducing power and total antioxidative activity,

episperm of tea seeds；procyanidin；radical；antioxidative activity

R285.3

A

2096-0387（2016）04-0001-03

国家自然科学基金项目（31260400）；江西省科技支撑计划项目（20151BBF60002）；江西省科学院重大科技专项（2016-YZD1-01）；江西省科学院青年基金项目（2013-YQC-6）。

熊伟（1982—），男（汉族），副研究员，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。