铜绿假单胞菌菌剂载体的筛选

王　微, 李圆萍, 谢惠玲, 肖清铁, 郑梅琴, 陈　燊, 何小三, 郑新宇, 林瑞余, 林文雄

(福建农林大学生命科学学院农业生态研究所, 福建 福州 350002)



铜绿假单胞菌菌剂载体的筛选

王微, 李圆萍, 谢惠玲, 肖清铁, 郑梅琴, 陈燊, 何小三, 郑新宇, 林瑞余, 林文雄

(福建农林大学生命科学学院农业生态研究所, 福建 福州 350002)

为将铜绿假单胞菌应用于重金属污染环境的生物修复，以硅藻土(1～3 mm)、硅藻土(3～6 mm)、活性炭和轻石为材料，通过测定不同材料的吸水率、菌体吸附与释放作用及制备菌剂的活菌数，筛选出适宜的菌剂载体.结果表明，在设定的载体浓度下(0～20 g·L-1)，不同载体的菌体去除率随浓度提高而增大，Q值在4.90%～49.60%之间；载体负载量随浓度提高而减小，L值在923.33～82.83 mg·g-1之间；硅藻土、活性炭的Q值在30 min达到最大.硅藻土(1～3 mm)、硅藻土(3～6 mm)、活性炭和轻石的吸水率依次为60.3%、43.3%、23.4%和33.1%；以上4种载体制备的菌剂(菌剂A、B、C和D)的活菌释放率依次为27.4%、28.8%、19.7%和37.1%.室温保存30 d后，菌剂A活菌数为6.25×108CFU·g-1，减少了78.4%，菌剂B活菌数为1.12×1010CFU·g-1，是初始值的5.38倍，菌剂C的活菌数为2.95×108CFU·g-1，减少了73.9%，菌剂D的活菌数为3.61×109CFU·g-1，增殖了127.0%.可见，载体浓度及吸附时间显著影响其对菌体的吸附作用，3～6 mm硅藻土的负载量适中，菌体存活率高，活菌释放率高，可作为铜绿假单胞菌的菌剂载体.

铜绿假单胞菌; 菌剂; 载体; 硅藻土; 活性炭; 轻石; 吸附作用

农田土壤重金属污染问题已引起人们的高度重视，研制微生物菌剂用于污染土壤的修复，可有效降低农产品安全风险，促进农田可持续经营.假单胞菌是广布于自然环境中的革兰氏阴性菌，具有氧化降解生物表面活性剂等作用，能在碳氢化合物、多氯联苯等污染的环境中存活[1-4]，还可通过外排泵及细胞内的氧化还原酶系统对重金属产生抗性，具有重金属污染修复潜力[5-7].铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一种众所周知的植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)，具有根际集群能力强、世代时间短、易于遗传操作、能够产生铁载体、分泌植物抗病物质及生长调节物质等作用，已被广泛用作生防菌[8,9].一些研究表明，铜绿假单胞菌具较强的重金属耐性和富集能力[10,11]，具有一定的重金属生物修复潜力；且有研究表明，芽孢杆菌制成的颗粒状菌剂已用于废水中金属离子的回收[12]；酵母菌R32经凝胶海藻酸钠包埋固定后可较好地去除水中六价铬[13].通过选择适当的载体，将具有根际促生作用的铜绿假单胞菌制成菌剂并用于农业重金属污染修复，可为农产品安全生产提供技术支持.现有可供选择的菌剂载体种类繁多、性能各异，以硅藻土最为常见，活性炭和轻石等载体亦具良好的吸附性能[14-20].硅藻土对水中Cd2+、Pb2+具有较好的吸附效果[21]，已有用做荧光假单胞菌P13菌剂的载体的研究报道[22]；活性炭是重金属的常用吸附剂[23]；轻石具有一定吸附能力并被用做光催化载体[24]，经赤泥改性的浮石吸附剂可去除水体中的砷[22]；周铁海等[25]也以浮石为载体，制备了La3+和Fe3+掺杂TiO2的复合光催化剂，用于去除污水中的TOC.目前，有关农田重金属污染修复微生物菌剂的研究极少，本课题组前期从水稻根际土壤分离出一株具有良好的镉富集能力的铜绿假单胞杆菌，该菌株对水稻生长有一定的促进作用.本研究通过评价硅藻土、活性炭及轻石作为菌剂载体的吸附作用、吸水率及其制备菌剂的有效菌体的释放率、菌体存活率等，筛选出合适的菌剂载体，为铜绿假单胞杆菌菌剂的开发与应用提供依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

载体材料硅藻土和轻石均购买自上海秋草园艺设备有限公司，硅藻土A的粒径为1～3 mm，硅藻土B的粒径为3～6 mm，呈灰白色，质地较软，质量轻，具有含大量微孔，空腔和通道的复杂结构；轻石又称浮石或浮岩，质量轻，能浮于水，多孔，表面粗糙，吸附能力较强.颗粒状活性炭购买自上海展云化工有限公司，黑色颗粒状，具多孔结构，比表面积约1 000 m2·g-1.各载体材料经过两次高压灭菌(121 ℃，30 min)、烘干后备用.供试铜绿假单胞杆菌菌株为课题组分离出的耐镉菌株(甘油保存，-80 ℃超低温冰箱)，菌株采用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化、培养，培养基pH 7.2，培养温度37 ℃.

1.2试验方法

1.2.1载体对菌体的吸附作用在无菌条件下，分别将0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 g载体加人到装有90 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL锥形瓶中，保持37 ℃,pH=7.2，混匀，然后加入10 mL培养24 h的菌悬液，在恒温摇床上吸附30 min, 测定不同载体的菌体去除率Q和载体负载量L[22].Q(%)=(C-C′)/C×100,菌体质量以细胞湿重计算，C、C′分别为吸附前后溶液中菌体的质量浓度(mg·L-1)；L(mg·g-1)=(C-C′)/C0,C0为载体用量(g·L-1).同时，分别称取1.0 g不同载体，加入100 mL的菌液中，设置载体浓度为10 g·L-1的处理,在吸附的5,10,15,20,25,30 min，分别测定菌体去除率Q和载体负载量L，分析两者随时间的变化.各处理设3次重复.

1.2.2不同载体吸水率的测定称取载体材料100 g，在无菌条件下，加入无菌水，混匀并使载体材料湿润，保持疏松、不结块，吸水率以100 g载体所含的液体量表示，各处理3次重复.

1.2.3菌剂的制备及其有效菌体释放率的测定称取等量的硅藻土A、硅藻土B、活性炭、轻石于小烧杯中，经两次高压灭菌，每次121 ℃处理30 min，65 ℃烘干备用；在无菌条件下，根据4种载体材料的吸水率加入铜绿假单胞菌菌液，混匀并保持载体材料湿润、疏松、不结块，制成菌剂.制备的菌剂依次命名为菌剂A、菌剂B、菌剂C和菌剂D，并放置在阴凉处室温保存.保存2 d后分别取0.1 g菌剂加入到盛有100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，37 ℃恒温摇荡2 h后，立即稀释涂布，测定有效菌体释放率，各试验3次重复.有效菌体释放率(%)=释放细菌密度/接种细菌密度(CFU)×100%[22].

1.2.4菌剂中菌体存活率的测定在菌剂室温保存的2、7、14和30 d，分别称取0.1 g菌剂，加人到盛有100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，恒温摇荡培养2 h后进行稀释涂布，测定活菌数，菌体存活率用测定值与初始菌数的比值表示，试验3次重复.

1.2.5数据处理与统计分析数据处理采用Microsoft Excel软件进行，统计分析采用DPS V7. 05和SPSS 17.0系统软件，样本平均数的差异显著性比较采用LSD法进行.

2　结果与分析

2.1载体浓度对吸附效果的影响

由图1可见，不同的载体菌体去除率Q均随载体用量的增加而增大.在载体浓度小于2 g·L-1时，活性炭的菌体去除率最高(11.2%)；在浓度为4 g·L-1时，Q值为：硅藻土A(18.5%)>活性炭(14.4%)>硅藻土B(11.7%)>轻石；在浓度大于4 g·L-1时，菌体去除率为：硅藻土A>硅藻土B>活性炭>轻石.在载体浓度为20 g·L-1时，4种载体对铜绿假单胞杆菌的去除能力分别为49.60%、41.57%、36.02%、19.40%.

载体负载量L随载体浓度的增大而减小(图1)，在载体浓度小于4 g·L-1时，L值为：硅藻土A>活性炭>硅藻土B>轻石；在浓度大于4 g·L-1时，L值为：硅藻土A>硅藻土B>活性炭>轻石；在浓度为20 g·L-1时，4种载体的L值分别为373.3、217.7、162.3、82.8 mg·g-1.

2.2吸附时间对吸附效果的影响

由图2可见，在0～5 min，4种载体对铜绿假单胞杆菌的吸附速率较高，Q值为：活性炭(26.4%)>硅藻土A(21.4%)>硅藻土B(17.4%)>轻石(16.6%)；负载量L值为：硅藻土A(211.7 mg·g-1)≈活性炭(194.6 mg·g-1)≈硅藻土B(142.3 mg·g-1)>轻石(129.4 mg·g-1)，前三者无显著差异.随着吸附时间的增加，载体的吸附速率明显下降，负载量逐渐增大.在处理30 min时，吸附基本达到平衡，以硅藻土A的菌体去除率和载体负载量最大, 硅藻土A、硅藻土B、活性炭及轻石的Q值依次为：48.1%、40.8%、43.0%、33.1%，L值依次是470.6、332.6、294.6、255.4 mg·g-1.

2.3不同载体材料的吸水率和有效菌体释放率

由表1可见，不同载体的吸水率存在显著差异，不同载体的吸水能力为:硅藻土A>硅藻土B>轻石>活性炭.活性炭有效菌体的释放率为19.7%，两种规格的硅藻土的有效释放率没有显著差异，分别为27.4%、28. 8%，轻石的有效释放率为37.1%，轻石、硅藻土均具有良好的释放作用.

表1　不同载体材料的吸水率和有效菌体释放率1)

1)小写字母表示,不同载体材料间,吸水率和有效菌体释放率的差异水平(P<0.05).

2.4不同菌剂的活菌数

在室温条件下,不同菌剂中的铜绿假单胞杆菌存活数量存在显著差异，且随保存时间的变化而变化(图3).在试验的保存时间内，菌剂A和菌剂C中的活菌数小于初始值，菌剂B和菌剂D中的活菌数大于初始值.由表1可见，不同菌剂接种后的活菌数量为：菌剂A(2.90×109)>菌剂B(2.08×109)>菌剂D(1.59×109)>菌剂C(1.13×109)，在保存30 d后，菌剂A活菌数为6.25×108CFU·g-1，减少了78.4%，菌剂B活菌数为1.12×1010CFU·g-1，是初始值的5.38倍，菌剂C的活菌数为2.95×108CFU·g-1，减少了73.9%，菌剂D的活菌数为3.61×109CFU·g-1，增殖了127.0%.

3　结论与讨论

通过比较不同材料及其制备菌剂的性能，发现3～6 mm硅藻土的吸附与释放能力均较好，制备的菌剂菌体的存活率高，可用于制备铜绿假单胞菌菌剂.3～6 mm硅藻土制备的菌剂保存30 d时的存活率高达540.6%，表明该载体的孔隙结构等有利于菌株的生长，每g菌剂含菌量为1.12×1010CFU，略高于马荣梅等[26]在最优条件下制备的菌剂的含菌量.3～6 mm硅藻土制备的菌剂室温下保存至30 d的含菌量高于1～3 mm硅藻土的，这可能与较大粒径的硅藻土具有的微孔、空腔和通道结构，更适合菌体存活与增殖.

本研究筛选的菌剂载体为单一载体，选择的硅藻土、活性炭及轻石均为常见材料，硅藻土的成本相对也较低，制备的菌剂性能较好，具有一定的应用前景.然马荣梅等[26]研究发现，对于液体XM菌剂，混合载体比单一载体的吸菌效果更好，更适合微生物的生长繁殖，叶峰等[27]则将具高效降解三苯类物质能力的活性污泥，进一步在由麦麸、红木屑、硅藻土组成的特定载体上发酵扩大培养，制成了复合菌剂.

本试验对铜绿假单胞菌菌剂载体材料的可行性及其性能进行了初步研究，关于混合载体或专用载体的筛选以及复合菌剂的制备等还有待深入研究，在本研究的基础上，有望为进一步提高菌剂的性能奠定基础.

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(责任编辑:吴显达)

Screening of carrier forPseudomonasaeruginosabacterial agent

WANG Wei, LI Yuanping, XIE Huiling, XIAO Qingtie, ZHENG Meiqin, CHEN Shen,HE Xiaosan, ZHENG Xinyu, LIN Ruiyu, LIN Wenxiong

(Institute of Agro-ecology, Collage of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forest University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To optimize the application ofPseudomonasaeruginosain bioremediation of heavy metal-polluted environment, carriers for bacterial agent, including diatomite at two particle sizes (1-3 mm and 3-6 mm), activated carbon and pumice were screened byP.aeruginosato evaluate their performances in bacteria adsorption and release, water absorption, and bacteria survival rate. Results showed that bacteria removal rates increased from 4.90% to 49.60% along with increasing concentrations of carrier from 0 g·L-1to 20 g·L-1. Conversely, loading capacity of carriers decreased from 923.33 to 82.83 mg·g-1when carrier concentrations increased. Diatomite and activated carbon reached the maximum bacteria removal rates 30 minutes after being exposed to bacterial agent. Bibulous rates for diatomite (1-3 mm), diatomite (3-6 mm), activated carbon and pumice were 60.3%, 43.3%, 23.4% and 33.1%, respectively, with living bacteria release rates reaching 27.4%, 28.8%, 19.7% and 37.1% accordingly. After being preserved at room temperature for 30 days, bacteria populations of diatomite (1-3 mm) and activated carbon decreased by 78.4% and 73.9%, reaching at 6.25×108CFU·g-1and 2.95×108CFU·g-1, while those of diatomite (3-6 mm) and pumice were 5.38 and 1.27 times higher than the initial populations, resulting in 1.12×1010CFU·g-1and 3.61×109, respectively. To summarize, carrier concentration and adsorption time significantly affected adsorption efficacy of bacteria carrier. Overally speaking, diatomite at particle size of 3-6 mm has moderate loading capacity, high bacteria survival rate and living bacteria release rate, and was considered an excellent material for carrier ofP.aeruginosaagent.

Pseudomonasaeruginosa; bacterial agent; carrier; diatomite; activated carbon; pumice; adsorption

2015-09-21

2015-10-20

福建省自然科学基金项目(2009J01056,2013J01083,2015J01081);福建省教育厅基金项目(JA09084);福建省高校服务海西建设重点项目(0B08B005);福建农林大学重点项目建设专项(6112c0604)和科技部科技基础性工作专项(2015FY111300)资助.

王微(1989-)，女，硕士研究生.研究方向：植物生理与分子生物学.Email:wal0713@163.com.通讯作者林瑞余(1968-)，男，教授.研究方向：作物生理生态与化学生态.Email:lrylin2004@163.com.

Q89; X5

A

1671-5470(2016)03-0325-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.015