云南粗茎秦艽斑枯病病原鉴定△

马维思，杨丽英，王馨，董志渊，李林玉，李绍平，严世武，杨斌

(云南省农业科学院 药用植物研究所，云南 昆明 650205)

云南粗茎秦艽斑枯病病原鉴定△

马维思，杨丽英，王馨，董志渊，李林玉，李绍平，严世武，杨斌*

(云南省农业科学院 药用植物研究所，云南 昆明 650205)

目的：明确云南种植的粗茎秦艽斑枯病的发生规律及病原菌的分类地位，以期为该病的防治提供依据。方法：通过田间调查掌握该病发生的基本规律，经组织分离、柯赫氏法则验证获得病原菌，依据真菌的形态特征和ITS序列特征确定其分类地位。结果：基于真菌形态和ITS序列特征，粗茎秦艽斑枯病病原被鉴定为小孢壳针孢Septoriamicrospora，该病在云南粗茎秦艽主要种植区普遍发生。结论：小孢壳针孢Septoriamicrospora是粗茎秦艽斑枯病病原菌。

粗茎秦艽；斑枯病；病原鉴定；小孢壳针孢

1 材料与方法

1.1 材料

粗茎秦艽斑枯病病株与接种用健康植株均采自丽江市玉龙县鲁甸乡拉美荣村粗茎秦艽基地，经云南省农科院药用植物研究所李绍平研究员鉴定为粗茎秦艽Gentianacrassicaulis。

PDA培养基：200 g马铃薯去皮切块浸煮，滤除残渣，20 g葡萄糖，17 g琼脂，加水定容至1 L，121 ℃高压湿热灭菌20 min。不加琼脂的PDA培养基为PD培养液。

Omega D3390-02真菌DNA小量提取试剂盒(广州飞扬生物工程有限公司)；2X PCR Master(Taq，染料)即用PCR扩增试剂盒[生工生物工程上海(股份)有限公司，简称生工生物]；真菌ITS通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)与ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)由生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1 病害调查 2013—2014年，在粗茎秦艽不同生长期，通过田间观察与走访，对云南丽江市玉龙县、迪庆州维西县等粗茎秦艽主产区的斑枯病发生情况进行调查，了解该病的发生规律。

1.2.2 病原菌的分离与形态鉴定 从病叶上采集病原物，在显微镜(凤凰PH100-3B41L-IPL)下，用显微镜摄像头(MC-D500U(C))拍照记录其特征，用Phmias2008 Cs ver3.0图像处理软件，分别测量50个分生孢子器和孢子的大小。采用组织分离法，从叶片病斑的病健结合处，剪取5 mm2左右的小块，用有效氯含量4.8%～6%的84消毒液分别浸泡40、60、80、100 s进行表面消毒，无菌水冲洗3次，将4片相同消毒时间的组织小块置于同一PDA平板上培养，将长出的真菌转接到新的PDA平板上，与病叶上病原物特征一致的真菌初步视为粗茎秦艽斑枯病病原菌，用于致病性测定。

1.2.3 致病性测定 取3盆3年生健康粗茎秦艽，每盆2株，从PDA平板上取真菌孢子配成浓度1×106个孢子·mL-1的孢子液，用毛笔将孢子液刷到叶片上进行接种，另取3盆植株刷清水作对照。将对照和接菌植株置于人工气候箱(上海一恒MGA-400H型)中，25 ℃、95%相对湿度，12 h光照、12 h黑暗培养，持续观察30 d。对发生斑枯病的病叶进行病菌再分离，与接种菌进行形态比较，依据柯赫氏法则确定病原菌。

天空中飘下了一抹水色，气腾腾的，像雾，像雨，又像风。不一会儿，一片天都变得灰蒙蒙的，无论是城市还是背影，在茫茫的烟水里连魁梧的轮廓都混沌了，更别提辨出谁是谁的寄托。

1.2.4 病原菌的分子鉴定 从PDA平板上挑取菌块，接种到含PD培养液的三角瓶中，25 ℃、140 r·min-1摇床培养120 h。培养好的菌液，10 000 r·min-1离心10 min，取沉淀。根据Omega D3390-02真菌DNA小量提取试剂盒说明书进行DNA提取，以真菌ITS4、ITS5为引物，用PCR扩增试剂盒扩增病原菌的ITS序列。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性1 min，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃补平5 min，4 ℃终止反应。PCR产物送生工生物进行双向测序。

测序结果在NCBI数据库进行BLAST比对，从比对结果中，选择已公开发表的、ITS序列相似度最高的10株菌，与粗茎秦艽斑枯病病原菌进行比较，经过CLASTALX 1.83进行序列比对，利用MEGA6软件，采用NJ(邻接法)构建系统发育树以确定病原菌的分类地位，系统树各分支的置信度用bootstra Ptest(自举检验法)检验，共进行1000次循环，根据Kimura-2参数计算各株遗传距离值。

2 结果与讨论

2.1 病害调查结果

粗茎秦艽一般播种育苗1年后移栽，移栽2～3年后采挖，经调查，在云南丽江市玉龙县、迪庆州维西县等主产区，1年生粗茎秦艽很少发生斑枯病，2～4年生植株均发病普遍，严重地块植株发病率高达100%。病原菌在植株残体上越冬，来年4月份新叶展开后即可见零星侵染，雨季到来后病情逐渐加重，其中8至9月发病最严重，斑枯病在田间常与锈病同时发生，一般不造成植株死亡，但导致叶片大面积枯萎，影响植株生长。

病害一般从近地面老叶的叶尖、叶缘开始发生，初生黄色、褐色小点，后扩大成近圆形不规则的病斑，病斑中央黄色至黄褐色，边缘红褐色，呈不明显的轮纹，外缘有靛青色的晕圈，随着病情加重，病斑扩大连成片，造成叶片大面积枯黄死亡，后期病斑中央产生深褐色的分生孢子器，多呈环状或片状聚集在叶片正面，背面较少(见图1A、B、C)。病斑上产生分生孢子器释放出的分生孢子成为粗茎秦艽生长期的传染源。

注：A.田间发病症状；B.病斑；C.分生孢子器；D.病叶上分生孢子。图1 粗茎秦艽斑枯病

2.2 病原菌的分离与形态鉴定

通过组织分离法获得一种与叶片真菌孢子形态特征相似的真菌，编号CJQJ，依据柯赫氏法则，取CJQJ的孢子接种健康粗茎秦艽叶片，出现典型的斑枯病症状，而对照植株健康未见发病(图2A)。从病斑上进行病原物的二次分离，获得与接种真菌形态特征一致的真菌，据此确定CJQJ为粗茎秦艽斑枯病病原菌。

病原菌CJQJ在叶片病斑上的分生孢子器呈扁球形，具1圆形孔口，分生孢子器初时透明，埋生于叶表皮下，逐渐成熟后颜色加深变成暗褐色并突破叶表皮，露出叶表皮的分生孢子器直径75.9～230.8 μm、平均(127.9±29.3) μm(见图1C)。分生孢子针形，直或弯，两端尖，基部较圆，有1～5(多为3)个隔膜，长16.2～29.4 μm、平均(22.1±2.8) μm，宽1.6～3.1 μm、平均(2.1±0.3) μm，孢子内具油球(见图1D)。

病原菌在PDA培养基上生长缓慢，25 ℃培养20 d后的菌落直径1.6 cm，菌落隆起，正面紫灰色，背面紫色，菌丝生长致密、具隔。将带菌丝的菌块转移到新的PDA培养基上，2周后能在接种菌块上产生大量分散的分生孢子器(见图2B菌落中央的深色部分)，扩散到新培养基上的菌落部分，只长菌丝而不产生分生孢子器(见图2B中灰白色的部分)。分生孢子器的形成首先是病原菌菌丝结集形成黑色乳突状结构，再从其顶端产生近无色透明的分生孢子器，随着体积的增加，分生孢子器颜色由无色透明逐渐变为肉红色，无明显的孔口，成熟的孢子器最后液化释放分生出孢子(见图2C)。PDA培养基培养长出的分生孢子较病叶产生的分生孢子短且分隔较少，披针形或镰刀形，长10.3～21.2 μm、平均(14.1±2.3)μm，宽1.6～3.5 μm、(2.6±0.4) μm，1～4个隔，多为1个隔(见图2D)。

依据寄主和真菌的形态特征，参考《中国真菌志》[4]，初步将粗茎秦艽斑枯病病原真菌鉴定为球壳孢目(Sphaeropsidales)壳针孢属(Septoria)真菌小孢壳针孢S.microspora。

注：A.致病性测定；B.菌落特征；C.分生孢子器；D.分生孢子。图2 致病性测定与PDA培养基上的病原菌特征

2.3 基于ITS序列的病原真菌鉴定

经双向测序获得粗茎秦艽斑枯病病原菌CJQJ 533bp的ITS序列，提交NCBI数据库进行BLAST比对，同源性最高的10株菌均为壳针孢属Septoria，其中序列登录号KC874679的菌株Septoriamicrospora与CJQJ菌株同源性最高，相似性达到99%，文献记载KC874679为甘肃产秦艽GentianamacrophyllaPall.斑枯病的病原菌[5]。

以1株序列编号GU237772的壳二孢属(Didymella)真菌为外群，从BLAST检索结果中，选已公开发表、且与CJQJITS序列相似度最高的10株菌，用MEGA6软件的NJ法构建系统发育树，结果见图3。粗茎秦艽斑枯病病原菌CJQJ与小孢壳针孢(S.microspora)KC874679关系最为密切，只有2碱基差异，处在同一分支，据此确定CJQJ的分类地位为小孢壳针孢S.microspora，与形态鉴定结果一致。

图3 基于真菌ITS序列构建的系统发育树

3 讨论

壳针孢(Septoria)引起的斑枯病是栽培龙胆科植物中较为常见的病害，鄢洪海等报道了龙胆草斑枯病由S.microsporaSpeg.和S.gentianaeThum.，S.gentinicolaBaudys et Picb 3种真菌引起，其中S.microspora是主要病原菌，危害性最强[6]。王艳、李金花等分别报道了甘肃栽培秦艽G.macrophylla、G.spp斑枯病的病原菌分别为S.microsporeSpeg.[5]和S.gentianaeThum.[7]。球壳孢目(Sphaeropsidales)真菌的分生孢子大小和颜色等特征在不同寄主植物可能出现比较大的差异，目前全世界报道的壳针孢属(Septoria)有2000种以上，其中有些是同物异名[2]。在本研究中，云南粗茎秦艽斑枯病S.microspora在病叶上的分生孢子，形态特征与PDA培养基上长出的孢子有较大差异，病叶上的孢子较长、针形，分隔数多为3，与王艳报道的甘肃产秦艽G.macrophylla斑枯病病菌S.microspora相似[5]，ITS序列同源性达99%，只有2bp的差异，而PDA培养基长出的孢子较短、披针形，多为1个隔，与李金花等报道的甘肃栽培秦艽G.spp斑枯病病原菌S.gentianae接近[7]，二者是否为同物异名需要进一步研究确定。

粗茎秦艽以滇西北地区种植面积最大，基本为农户自发分散种植，病害防治做不到统防统治，无法从源头上彻底消除病原，导致斑枯病普遍持续发生。实践证明，适时施用合适的杀菌剂对该病具有很好的防治效果。病害发生前喷施代森锰锌、福美双等保护性杀菌剂进行预防，病害发生后，喷施1～2次多菌灵、三唑酮等内吸性杀菌剂，对粗茎秦艽斑枯病及伴生的锈病均有很好的控制作用。秋末粗茎秦艽地上部分枯萎后，及时清理并集中烧毁干枯残体，可有效减少越冬病原，对控制来年病害的发生也有积极作用。

致谢：论文撰写过程中得到中国医学科学院药用植物研究所陈君老师的亲切指导，本研究所需实验仪器得到云南省农业科学院药用植物研究所季鹏章博士的直接帮助，在此致以谢意！

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：270-271.

[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第62卷[M].北京：科学出版社，1988：68.

[3] 聂燕琼，李海彦，孙娜，等.粗茎秦艽资源研究进展[J].中国现代中药，2012，14(5)：37-40.

[4] 鄢洪海，夏淑春，于莉，等.龙胆草斑枯病的发生与病原菌鉴定[J].植物保护学报，1999，26(4)：315-318.

[5] 白金铠.中国真菌志：第17卷·球壳目·壳二孢属壳针孢属[M].北京：科学出版社，2003：211-212.

[6] 王艳.甘肃省药用植物球壳孢目真菌病害及其病原研究[D].兰州：甘肃农业大学，2013.

[7] 李金花，柴兆祥，王蒂.秦艽斑枯病病原菌鉴定及生物学特性研究[J].中药材，2007，30(1)：3-6.

PathogenIdentificationofGentianacrassicaulisLeafSpotinYunnanProvince

MA Weisi，YANGLiying，WANGXin，DONGZhiyuan，LILinyu，LIShaoping，YANShiwu，YANGBin*

(InstituteofMedicinalPlants，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming650205，China)

Objective：To identify the pathogen ofGentianacrassicaulisleaf spot in Yunnan province.Methods：The pathogen was isolated from leaf spot ofG.crasicauliswith Potato Dextrose Agar medium，tested and verified with Koch’s postulates，and identified Based on morphological and ITS DNA sequence.Results：The pathogen was identified asS.microspora.Conclusion：S.microsporais the pathogen ofG.crasicaulisleaf spot.

Gentianacrasicaulis；leaf spot；pathogen identification；Septoriamicrospora

2016-03-01)

云南省科技创新强省计划项目(2014AE015)；云南省科技创新人才计划(2015HB102)

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杨斌，副研究员，研究方向：药用植物规范化栽培；Tel：(0871)65033575，E-mail：yb0872@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.008