中药熏蒸联合InfIiximab治疗类风湿性关节炎疗效及与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关性

崔永建　张红霞　王　英　李　艳

(新疆医科大学第六附属医院风湿免疫科1,中医科2,急诊科3,乌鲁木齐,830002)



中药熏蒸联合InfIiximab治疗类风湿性关节炎疗效及与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关性

崔永建1张红霞2王英1李艳3

(新疆医科大学第六附属医院风湿免疫科1,中医科2,急诊科3,乌鲁木齐,830002)

目的:观察中药熏蒸联合InfIiximab治疗类风湿性关节炎疗效,并探讨其疗效与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关性。方法:随机选取2014年8月至2016年4月于我院内分泌科诊及住院部就诊的脑中风患者110例,以甲氨蝶呤片基础治疗基础上采用中药熏蒸联合InfIiximab治疗类风湿性关节炎。治疗前和最后一次治疗后,采用28处关节疾病活动度(DAS28)和健康评估问卷(HAQ)评定,作为RA患者疗效的评定标准。采用高通量荧光PCR检测TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性。结果:中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA,治疗后DAS28评分和HAQ评分均比治疗前低(P<0.05),说明中药熏蒸联合InfIiximab能有效治疗RA。而在TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性中仅GG基因型治疗后DAS28评分和HAQ评分均低于治疗前(P<0.05),而AA基因型和AG基因型在这两项评分中差异均无统计学意义(P>0.05)。中药熏蒸联合InfIiximab治疗后临床缓解情况,TNF-α基因-238位点单核苷酸GG型84例,AG型5例,AA型2例,GG型的临床缓解率显著高于AG型(χ2=26.134,P=0.000<0.05)和AA型(χ2=44.872,P=0.000<0.05)。结论:中药熏蒸联合Infliximab能有效治疗RA,且其疗效与TNF-α基因-238位点的单核苷酸基因多态性可能相关,其中对GG型治疗效果最佳,而AG型和AA型疗效反应则相对较差。

中药熏蒸;InfIiximab;类风湿性关节炎;TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种好发于女性的以关节滑膜为主的结缔组织广泛发生的免疫性炎性反应,该病有一定致畸性[1]。RA的发病机制较为复杂,目前有研究发现细胞因子(如TNF-α、IL-6等)引起滑膜衬里细胞增殖、微血管新生和单核/巨噬细胞浸润[2-3],这些产物反作用于免疫细胞,进一步扩大RA自身免疫反应的发生和发展。RA属于中医学中“痹症”“尪痹”和“历节”的范畴,致病因素多因外感风寒湿邪,内致瘀血痹阻,正气不足,本虚标实。目前RA的治疗还是一个医学难题,目前主要以缓解疼痛和保护肌肉关节功能为主要目的,西医疗法多采用抗风湿药(英夫利昔单抗,Infliximab),抗炎药和生物制剂等[4],而中医疗法采用中药熏蒸、针灸拔罐、中药辨证治疗等[5]。中药熏蒸是通过煎煮药物产生药物蒸汽,蒸汽熏疗全身或者患处,促进患者机体功能的恢复,该疗法疗效颇佳、不良反应较少,适宜推广应用。研究表明中药熏蒸疗法有效治疗RA[6],且能够降低促炎性细胞因子肿瘤细胞因子(TNF-α)水平[7]。Infliximab已被证实联合甲氨蝶呤能够迅速改善RA患者的临床症状,降低其TNF-α的表达水平,然而研究中也显示虽然Infliximab未见明显不良反应[8],但是有效率仅约66.7%,可能与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关[9]。因此,本研究采用中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA,旨在观察其疗效,并探讨其疗效与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关性。现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料随机选取2014年8月至2016年4月,于我院风湿科门诊及住院部就诊的类风湿关节炎患者110例，其中女81例,男29例;年龄18～76岁,平均年龄(35.04±9.31)岁;平均病程(6.92±4.57)年。

1.2诊断标准类风湿关节炎西医诊断,参照2009年ACR和EULAR联合颁布的RA诊断标准[10];中医参照2002年试行《中药新药临床研究指导原则》[11]中RA中医辨证分型。

1.3纳入与排除标准纳入标准:1)符合上述诊断标准;2)符合类风湿关节炎活动期判断标准;3)受试者自愿并签署知情同意书的患者;4)对临床实验研究意义有正确认识,对研究人员的观察和评价有有良好的依从性;5)停用本研究未提及的其他类抗类风湿关节炎药物至少1个月以上。

排除标准:1)不符合上述诊断标准和纳入标准的患者;2)1个月内接受过皮质类固醇关节腔内注射治疗;3)既往有活动性结核病史或正处感染期;4)合并有心脑血管、肝、肾和造血系统等严重危及生命的原发性疾病以及精神病患者。

1.4治疗方法1)基础治疗:甲氨蝶呤片(由通化茂祥制药有限公司提供，规格:2.5 mg,批号:H22022674)，每周10 mg/次。2)中药熏蒸:应用我科常用类风湿Ⅰ方,药物组成为制川乌20 g、制草乌20 g、透骨草30 g、海风藤30 g、鸡血藤30 g、青风藤30 g、羌活20 g、独活20 g、细辛10 g、土鳖虫15 g、桂枝15 g、防风15 g。所有中药由我院中药房提供。用纱布包裹将类风湿Ⅰ方并置于中药汽疗仪(厂家:深圳市中新浩医学科技有限公司，型号:SH-800P-7型),中药汽疗仪将药物煮沸后,将蒸汽温度设为38 ℃,嘱患者躺入仪器中,露出头颈部,熏蒸20 min。1次/d,5 d为1个疗程,间隔2 d,治疗14周。3)Infliximab静脉输注:分别于第0、2、6、14周给患者静脉输注3 mg/kg的Infliximab(中文名:英夫利昔单抗,商品名:类克,厂家:武汉瑞立升科技发展有限公司，批号:CB01027020)。

1.5疗效评估治疗前和最后一次治疗后,采用28处关节疾病活动度(DAS28)和健康评估问卷(HAQ)评定,作为RA患者疗效的评定标准。根据美国风湿病学会中RA临床缓解标准,本研究患者HAQ整体评估≤1,治疗前和最后一次治疗后实验室检查中的红细胞沉降率(ESR):男性<20 mm/h,女性<15 mm/h和C反应蛋白(CRP):≤1 mg/dL,结合关节的肿胀和疼痛数量均≤1。采集患者静脉血3 mL以检测类风湿因子等一般情况。

1.6TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性检测治疗前和最后一次治疗后采集患者静脉血5 mL于EDTA抗凝管,严格遵循小量全血基因组DNA提取试剂盒(货号:DP1101,北京博凌科为生物科技有限公司)说明书提取全血DNA,-80 ℃保存代用。TNF-α基因-238和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物和探针序列设计和产品生成均由上海生工负责,TNF-α基因-238和GAPDH探针引物序列见表1。根据购于美国ABI公司的TNF-α基因-238的探针MGB等位基因分型试剂盒逐步操作,最终在高通量荧光定量PCR仪(型号:PRISM 7900型,美国应用生物系统公司上海分公司)进行预变性、变性、退火延伸、循环再延伸的PCR反应,再以SDS 2.0软件以上述获得结果进行基因分型。

1.7统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理,计量资料以(均数±标准差)表示,组间比较当方差齐时采用方差分析或t检验,不齐采用秩和检验;组内用配对t检验进行组间分析。计数资料采用非参数卡方等检验。相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

表1　TNF-α基因-238和GAPDH探针引物序列

2　结果

2.1TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性含有GG型、AG型和AA型,分别有91、12、7例,其分型占比和各等位基因频率。见图1。

2.2各基因分型RA患者一般情况TNF-α基因-238位点单核苷酸各基因型间的年龄和病程差异无统计学意义(P>0.05),而性别、类风湿因子阳性和X线片分期差异均有统计学意义(P<0.01),说明女性较男性患RA的概率高,以中后期患者为主,及大多数患者能检测出类风湿因子阳性,对RA的诊断具有代表性。见表2。

图1　TNF-α基因-238的分型比例和等位基因频率表2　各基因分型RA患者一般情况比较

项目GG型(91)AG型(12)AA型(7)χ2/tP年龄(岁)34.82±10.2435.17±8.6535.64±7.985.350.879性别(男/女)25/663/91/624.580.000病程(年)6.84±3.377.03±4.116.96±4.266.1360.824类风湿因子(阳性/阴性)76/159/36/147.130.000X线片分期38.340.000Ⅰ期621Ⅱ期5752Ⅲ期1843Ⅳ期1011

2.3中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA疗效及与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关性中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA,治疗后DAS28评分和HAQ评分均比治疗前低(P<0.05),说明中药熏蒸联合InfIiximab能有效治疗RA。而在TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性中仅GG基因型治疗后DAS28评分和HAQ评分均低于治疗前(P<0.05),而AA基因型和AG基因型在这2项评分中差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA后TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性各基因型的临床缓解率中药熏蒸联合InfIiximab治疗后临床缓解情况,TNF-α基因-238位点单核苷酸GG型84例,AG型5例,AA型2例，GG型的临床缓解率显著高于AG型(χ2=26.134,P=0.000<0.05)和AA型(χ2=44.872,P=0.000<0.05)。见图2。

图2　中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA后TNF-α基因-238 位点单核苷酸多态性各基因型的临床缓解率

2.5安全性分析严格无菌操作进行静脉输注、规范的中药熏蒸流程均未出现不良事件,安全性良好。

3　讨论

《黄帝内经》云:“风寒湿三气杂至合而为癖也。其风气胜者为行癖,寒气胜者为痛癖,湿气胜者为着搏也”,由此可知中医学的RA主要由风寒湿邪引起的。《黄帝内经》提出“其邪者,渍形以为汁”,此处的“渍形”即中药熏蒸。人体皮肤的表面积最大,通过对药物的煮沸熏蒸肌肤,药物中的有效成分在蒸汽的作用下被人体透皮吸收,已达到治疗作用;同时蒸汽促进全身或局部血液循环,加速组织新陈代谢排出炎性反应物质。中药熏蒸属于中药外治的范畴,本研究中所用中药以祛风湿止痹痛为主,制川乌、制草乌、羌活、独活、细辛、桂枝、防风,祛风寒湿邪,此类药物具有抗炎止痛解痉的作用;配伍活血祛瘀类药物透骨草、土鳖虫,改善全身和局部的血液循环,通则不痛;佐藤类药物海风藤、鸡血藤、青风藤,疏通经络,祛除风湿。

RA是一种致残率较高的自身免疫性疾病,多累及关节滑膜,长期可能引起关节软骨和骨头的破坏。

表3　中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA疗效及与TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性的相关性

TNF-α是一种参与各种免疫和炎性反应的促炎性细胞因子,当其过表达时打破机体内免疫平衡状态,促进RA患者滑膜内炎性反应,造成软骨和骨的损伤。动物实验显示[12]采用TNF-α单克隆抗体治疗RA模型鼠可以缓解的关节炎性反应等症状,而作为人鼠嵌合TNF-α单克隆抗体的Infliximab,其疗效和安全性被许多研究证实[5,13-14]。然而其无效率(33.3%)略高[8],因此假如可以预先排出这部分Infliximab治疗无效的患者,将能节约大量的医疗资源,同时也使患者减轻不必要的经济负担和避免延误患者病情。

本研究结果显示,中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA,治疗后DAS28评分和HAQ评分均比治疗前低(P<0.05),说明中药熏蒸联合InfIiximab能有效治疗RA。而在TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性中仅GG基因型治疗后DAS28评分和HAQ评分均低于治疗前(P<0.05),而AA基因型和AG基因型在这2项评分中差异均无统计学意义(P>0.05)。中药熏蒸联合InfIiximab治疗后临床缓解情况,TNF-α基因-238位点单核苷酸GG型84例,AG型5例,AA型2例,如图2所示,GG型的临床缓解率显著高于AG型(χ2=26.134,P=0.000<0.05)和AA型(χ2=44.872,P=0.000<0.05)。研究报道发现[15-16]InfIiximab对TNF-α基因-238位点单核苷酸中AG基因型的疗效相对GG型较差,显示InfIiximab治疗RA的疗效与TNF-α-238基因多态性有关,与本研究结果相似。

由此,本研究初步表明,中药熏蒸联合InfIiximab能有效治疗RA,减轻RA的临床症状,且TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性与中药熏蒸联合InfIiximab的疗效相关,未来将进一步研究TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性对中药熏蒸联合InfIiximab治疗RA疗效的预测价值,通过检查TNF-α基因-238位点单核苷酸多态性,选择GG型进行本研究治疗方案疗效较佳。

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(2016-05-30收稿责任编辑：王明)

Efficacy of Chinese Medicinal Fumigation Combined with InfIiximab in Treatment of Rheumatoid Arthritis and Its Correlation with the TNF-α gene-238 Gene Single Nucleotide Polymorphism

Cui Yongjian1,Zhang Hongxia2,Wang Ying1,Li Yan3

(XinjiangMedicalUniversitySixthaffiliatedHospital1RheumatologyDepartment;2ChineseMedicineDepartment;3EmergencyDepartment,Urumqi830002,China)

Objective: To observe the curative effect of Chinese medicinal fumigation combined with InfIiximab in the treatment of rheumatoid arthritis, and to explore the correlation between the curative effect and the single nucleotide polymorphism of-238 gene TNF-α locus. Methods: There were 110 cases of stroke patients in endocrinology clinic and inpatient department in our hospital during August 2014 to April 2016. The rheumatoid arthritis patients were treated with Chinese medicinal fumigation combined with InfIiximab on the basis of Methotrexate Tablets. And 28 joint disease activity (DAS28) and health assessment questionnaire (HAQ) were used to assess the efficacy of RA patients before and after the treatment. Detection of single nucleotide polymorphism of-238 gene in TNF-α gene was performed by high throughput fluorescence PCR. Results: The DAS28 score and HAQ score were lower after treatment (P<0.05), which showed that Chinese medicinal fumigation combined with InfIiximab can effectively treat RA. And in TNF-α gene 238 single nucleotide polymorphisms, only GG genotype′s DAS28, HAQ scores dropped after treatment (P<0.05), and AA and AG genotypes had no significant differences in the two scores (P>0.05). As for Chinese medicinal fumigation treatment combined with InfIiximab clinical remission, there were 84 cases of TNF-α gene 238 nucleotide GG genotype, 5 cases AG type and 2 cases AA type, GG type of clinical remission rate was significantly higher than that of AG (χ2=26.134,P=0.000<0.05) and the AA type(χ2=44.872P=0.000<0.05). Conclusion: Chinese medicinal fumigation and infliximab can be effective in the treatment of RA, and its efficacy may be related to 238 locus and TNF-α gene single nucleotide polymorphism, which could be the best treatment of GG genotype, but the treatment of AG and AA genotype are relatively poor.

Chinese medicinal fumigation; InfIiximab; Rheumatoid Arthritis; TNF-α gene-238 gene single nucleotide polymorphism

新疆自治区自然科学基金项目(编号:2014ZRQN11)

崔永建(1976.10—),男,硕士,主治医师,主要研究方向:风湿病,E-mail:cai1179@126.com

R274.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.013