艾灸对动脉硬化模型ApoE-/-小鼠纤溶-凝血因子的调控作用研究

杨　佳　赵百孝　哈　略　黄　畅　和　蕊

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029)



艾灸对动脉硬化模型ApoE-/-小鼠纤溶-凝血因子的调控作用研究

杨佳赵百孝哈略黄畅和蕊

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029)

目的：观察艾灸对动脉硬化小鼠凝血-纤溶系统的调控效应；方法：实验分为正常组(C57BL/6小鼠)、模型组、艾灸膻中组、氯吡格雷干预组(阳性组)，其中模型组、艾灸组及氯吡格雷组均选用动脉硬化模型ApoE-/-小鼠，每组15只小鼠，高脂喂养；正常组选用C57BL/6小鼠作为对照，普通饮食喂养。正常组和模型组小鼠釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，不予任何处理，每日抓取固定20 min；艾灸膻中组小鼠釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位后，固定器底板处设有小孔,可暴露胸部膻中穴,点燃特制艾条放置小鼠腹部下方,使灸火透过固定器底部小孔传至小鼠膻中穴。用特制艾条灸膻中20 min；阳性药组小鼠：口服给予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)。各组干预6 d/周，16周后牺牲动物，心脏取血，用Elisa法检测血浆中纤溶系统标志因子t-PA、PAI-1；凝血系统的标志因子TXB2、6-Keto-PGF1a及参与血小板活化过程的重要黏附因子vWF的表达；结果：与模型组相比，艾灸提高血浆中t-PA含量，但无统计学意义，P>0.05；与模型组相比，艾灸显著性降低血浆内PAI-1的含量，P<0.05；与模型组相比，艾灸显著性降低黏附因子VWF的含量，P<0.05；与模型组相比，艾灸显著性提高血浆中6-Keto-PGF1α的含量，P<0.05；与模型组相比，艾灸增加血浆中TXB2含量，但无统计学意义，P>0.05。结论：艾灸对凝血-纤溶系统有良好的调节作用，可以通过下调PAI-1的含量，提高纤溶系统的活性，上调6-Keto-PGF1α/TXB2的比值，降低黏附因子vWF，进一步发挥其调控血小板活化，防治动脉硬化的效应。

艾灸；动脉粥样硬化；凝血-纤溶系统

中医学认为饮食劳倦，七情内伤，素体虚弱，寒邪凝滞等因素导致心脏的气滞血瘀、阴阳失调而成动脉硬化性心脑血管疾病，艾灸以其活血化瘀、温阳补虚的优势被广泛推广应用到心脑血管疾病的防治中。用艾灸可活血化瘀，温散寒邪，鼓动阳气，推动血液的运行，使瘀滞消散，从而防止血栓的形成。本实验釆用ApoE-/-小鼠为观察对象，检测小鼠血浆中纤溶系统的标志因子t-PA、PAI-1；凝血系统的标志因子TXB2、6-Keto-PGF1a及参与血小板活化过程的重要介导因子vWF的表达，观察艾灸对ApoE-/-小鼠的凝血-纤溶系统的调控效应。

1　实验材料

1.1实验动物本实验选用8周龄载脂蛋白E基因敲除小鼠ApoE-/-小鼠作为动脉粥样硬化模型，同龄相同遗传背景非转基因小鼠C57BL/6作为空白对照。小鼠均购自于北京大学医学部实验动物科学部。ApoE-/-小鼠釆用高脂饲料(北京维通利华实验动物有限公司提供,含15%猪油、2%胆固醇、0.05%胆酸)喂养,C57BL/6釆用常规饲料喂养。所有小鼠均可自由进食饮水；饲养环境温度为(22±2)℃，湿度为50%～60%左右。釆用人工控制室内照明,保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8：00)交替循环。

1.2主要试剂及仪器细艾条:规格(0.5 cm×20 cm),购自河南南阳汉医艾绒有限公司;小鼠固定器:规格(150 mm×65 mm×50 mm)，可固定小鼠头、尾、四肢部位,底板处设有小孔,可暴露腹部,购自上海华岩仪器设备有限公司;P5L2C光散射式微电脑数字粉尘测试仪：购自北京宾达绿创科技有限公司；t-PA、PAI-1、vWF的ELISA试剂盒：购自鼎国生物技术有限公司；TXB2、6-Keto-PGF1α放射免疫药盒：购自鼎国生物技术有限公司；3kl5型低温高速离心机，柠檬酸盐采血管(1∶9):NEWPROBE生物有限公司。

2　实验方法

2.1动物分组及处理实验分为空白组(C57BL/6小鼠)、模型组、艾灸膻中组、氯吡格雷干预组(阳性组)，其中模型组、艾灸组及氯吡格雷组均选用动脉硬化模型ApoE-/-小鼠，每组15只小鼠，高脂喂养；空白组选用C57BL/6小鼠作为对照，普通饮食喂养。

空白组、模型组小鼠：釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，不予任何处理，每日抓取固定20 min。

艾灸膻中组小鼠：釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位后，固定器底板处设有小孔,可暴露胸部膻中穴,点燃特制艾条放置小鼠腹部下方,使灸火透过固定器底部小孔传至小鼠膻中穴。用特制艾条灸膻中20 mim。

阳性药组小鼠：口服给予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)。

各组干预6 d/周，16周后牺牲动物，检测各项指标。

2.2取材及检测小鼠取血后放入含有3.8%柠檬酸盐抗凝采血管中,血与抗凝剂比例9∶1，轻轻颠倒混匀,3 000 r/min,离心15 min,取上清,-80 ℃保存,待测血浆中凝血-纤溶因子。

2.3ELISA酶联免疫吸附法检测血浆中t-PA、PAI-1、vWF、TXB2、6-Keto-PGF1α

2.3.1血浆中t-PA、PAI-1的检测1)将各种试剂移至室温(18～25 ℃)平衡，按前述方法配制试剂，备用。

2)加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加100 μL标准品或待测样本(使用样品稀释液稀释2倍)，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37 ℃孵育2 h。

3)弃去液体，甩干，不用洗涤。

4)每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃孵育1 h。

5)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

6)每孔加HRP-链酶亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃孵育1 h。

7)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

8)每孔加底物溶液90 μL，覆上新的板贴，37 ℃避光孵育15～30 min。

9)依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。

10)在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标做标准曲线。根据样本OD值，计算出相应的浓度。

2.3.2血浆中vWF的检测1)将各种试剂移至室温(18～25 ℃)平衡，按前述方法配制试剂，备用。

2)加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加100 μL标准品或待测样本(使用样品稀释液稀释4倍)，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37 ℃孵育2 h。

3)弃去液体，甩干，不用洗涤。

4)每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃孵育1 h。

5)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

6)每孔加HRP-链酶亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃孵育1 h。

7)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

8)每孔加底物溶液90 μL，覆上新的板贴，37 ℃避光孵育15～30 min。

9)依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。

10)在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标做标准曲线。根据样本OD值，计算出相应的浓度。

2.3.3血浆中TXB2、6-Keto-PGF1α的检测1)将各种试剂移至室温(18～25 ℃)平衡，按前述方法配制试剂，备用。

2)加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加100 μL标准品或待测样本(使用样品稀释液稀释2倍)，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37 ℃孵育2 h。

3)弃去液体，甩干，不用洗涤。

4)每孔加生物素标记抗体工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃孵育1 h。

5)弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

6)每孔加HRP-链酶亲和素工作液100 μL，覆上新的板贴，37 ℃孵育1 h。

7)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

8)每孔加底物溶液90 μL，覆上新的板贴，37 ℃避光孵育15～30 min。

9)依序每孔加终止溶液50 μL，终止反应。

10)在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

以标准品的浓度的对数为纵坐标，OD值为横坐标做标准曲线。根据样本OD值，计算出相应的浓度。

3　统计学方法

4　结果

4.1各组小鼠血浆中t-PA的含量各组t-PA的含量有空白组<模型组<氯吡格雷组<艾灸组的趋势，但各组间无统计学意义，P>0.05，提示艾灸对血浆中t-PA含量无明显影响。见表1。

4.2各组小鼠血浆中PAI-1的含量与模型组相比，空白组、艾灸组、氯吡格雷组PAI-1含量均下降，其中空白组和艾灸组PAI-1含量显著性降低，P<0.01，氯吡格雷组PAI-1含量略微降低，但无统计学意义，P>0.05。提示艾灸通过下调PAI-1来提高纤溶系统的活性。见表2。

表1　各组小鼠血浆中t-PA的含量

表2　各组小鼠血浆中PAI-1的含量

注：与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

4.3各组小鼠血浆中黏附因子VWF的含量与模型组相比，空白组、艾灸组、氯吡格雷组VWF含量均下降，其中空白组VWF含量显著性降低，P<0.01，艾灸组和氯吡格雷组VWF亦显著性下降，P<0.05，艾灸组VWF含量略高于氯吡格雷组，但无统计学意义，P>0.05。见表3。

表3　各组小鼠血浆中VWF的含量

注：与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

4.4各组小鼠血浆中6-Keto-PGF1α的含量与模型组相比，空白组、艾灸组、氯吡格雷组6-Keto-PGF1α含量均上升，其中空白组上升无统计学意义，P>0.05，艾灸组与氯吡格雷组6-Keto-PGF1α含量显著性升高，P<0.05，氯吡格雷组6-Keto-PGF1α含量略高于艾灸组，但无统计学意义，P>0.05，提示艾灸通过上调6-Keto-PGF1α含量来影响凝血-纤溶系统，从而影响动脉硬化的发生，其也为抗动脉硬化的作用机制之一。见表4。

表4　各组小鼠血浆中6-Keto-PGF1α的含量

注：与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

4.5各组小鼠血浆中TXB2的含量与模型组相比，艾灸组和氯吡格雷组TXB2含量均有上升趋势，但无统计学意义，P>0.05，空白组TXB2含量略微下降，无统计学意义，P>0.05，艾灸组TXB2含量略高于氯吡格雷组，但无统计学意义，P>0.05，提示艾灸对TXB2含量无明显影响。见表5。

表5　各组小鼠血浆中TXB2的含量

5　讨论

纤溶系统是一种抗血管内血栓形成的内皮防御系统，其中，t-PA和PAI-1是纤溶系统的一对关键性调节因子。[1]组织型纤溶酶原激活物(t-PA)由血管内皮细胞合成并释放，可激活纤溶酶原，使血块溶解;纤溶酶原激活抑制物1型(PAI-1)是血浆中t-PA的重要生物抑制剂，来源于内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝脏、血小板等;PAI-1经合成分泌后，与血浆中游离的t-PA快速结合，阻碍t-PA激活纤溶酶原，使血块不易溶解，促进血栓形成[2-3]。生理条件下PAI-1和t-PA共同调节着纤溶系统的平衡，二者间的失衡可导致血栓和出血的发生。实验结果显示，艾灸可以显著性降低血浆内PAI-1的含量，说明艾灸可以提高纤溶系统的活性，从而抑制血小板活化，干预动脉硬化的进展。

TXA2和PGI2同属细胞膜释放的花生四炼酸的主要代谢产物，TXA2是较强的血管收缩剂和血小板聚集诱导剂，而PGI2具有很强的扩张血管和抑制血小板聚集作用。TXA2与TXA2受体结合，偶联Gq蛋白，激活PLC，增加胞质[Ca2+]i，引起血小板聚集。PGI2与膜上的PG受体结合，偶联Gs蛋白，激活腺苷酸环化酶(AC)，增加cAMP含量，降低胞质[Ca2+]i，抑制血小板聚集[4-6]。在正常生理状态下二者处于平衡状态，对维持人体血液的正常流动状态起着重要的作用。研究表明，脑缺血、心肌梗死、动脉硬化等心脑血管疾病状态下，脑中PGI/TXA2的比值明显下降[7-8]。TXA2和PGI2不稳定，半衰期都非常短，TXB2和6-Keto-PGF1α分别是TXA2和PGI2的稳定代谢产物，故测定TXB2和6-Keto-PGF1α的水平可直接反映TXA2和PGI2的变化。研究结果显示艾灸显著性提高血浆中6-Keto-PGF1α的含量，提高6-Keto-PGF1α/TXA2的比值。说明艾灸通过良性调节血浆凝血-纤溶系统，发挥其调控血小板活化，干预动脉硬化的病理过程。

血小板与内皮下组织的黏附是血栓形成的启动环节，血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)介导这一过程，vWF可与胶原及血小板膜糖蛋白GP I b和GPlIb-IIIa结合，在血小板聚集中起到桥梁连接作用[9-10]。本研究结果显示艾灸显著性降低黏附因子VWF的含量，说明艾灸减低黏附因子亦参与到抗动脉硬化的作用中。

本研究结果与以往的临床及基础研究均表明艾灸对血液流变学及凝血-纤溶系统有良性调节作用相符。唐照亮等实验发现，艾灸可降低寒凝血瘀模型大鼠的血浆、全血黏度、RE以及Ht从而改善寒凝血瘀证大鼠的血瘀症状。吴氏等发现艾灸可对血浆中的TXB2和6-酮-PGF12有良性调节作用，使高凝状态的血流得到改善，血小板凝聚性降低，血流速度加快，促使血栓溶解，使原缺血区的神经细胞得以恢复，也可使处于水肿或将要变性的细胞正向转化，从而纠正高脂血症的发生，也有效的预防了动脉粥样硬化等心脑血管疾病的发生[11]。黄氏[12]等发现艾灸治疗原发性高血压病程中，其全血黏度、纤维蛋白原含量、血浆黏度、血细胞比容、血小板聚集率以及血液胆固醇、三酰甘油等与血黏度有关的成分均有下降，证明艾灸对血液化学成分及血液黏度有良性调整作用，可以改善高血压患者血液浓、黏、凝、聚状态，降低外周阻力，从而改善微循环，调节局部血氧供应和代谢，对缓解和阻止高血压病情的恶性循环有积极意义[13]。

艾灸能够起到活血通络的作用可能与艾叶的药性作用以及艾燃烧生成物的芳香作用有关[14-16]。艾作为最佳的施灸材料，性苦微温，气味芳香，与其他材料相比，具有一定的药性作用优势，艾的芳香辛燥之气是艾灸对机体产生效应的机制之一。现代研究发现，艾叶的主要成分是挥发油，所含化学成分主要有:α-菔稀、藏稀、α-松油稀、Y-松油稀、桉叶素、2-环己稀-1-醇、棒脑、龙脑、4-松油醇、反式-石竹稀、丁子香酚，其中具有药效作用的成分有桉叶素、樟脑、龙脑、甘菊环等[17]，这些成分也存在于罗勒、迷迭香、桉叶油等[18]。

中医药学认为，芳香性药物以化湿和开窍为两大主要功效。中药药理研究证明，芳香性中药是一些具特别香气的药物，具有鼓舞正气、除邪辟秽、解肌发表、疏风散邪，芳香健脾、化湿醒脾，通关开窍、止痛消肿等功效，芳香药物的作用在于“率领群药开结行滞，直达病所，俾令攻决，无不如志，一归于气血流通，而病自已”。这些特点与芳香性中药所有的特殊药理性质有关[19-20]。这些芳香物质可以对人体神经系统、血液循环系统、消化系统、呼吸系统、皮肤、泌尿系统都存在着治疗和辅助治疗作用[21-22]，可以促进血液运行，加快微循环，调节新陈代谢，加快体内毒素排除、消炎杀菌，扩张外周血管、降低血压、增加心灌流量等多方面心血管调节作用[23-24]。

目前普遍认为芳香物质可经嗅觉系统传入大脑，抑制或兴奋中枢神经系统，亦可通过呼吸或皮肤渗透进入血液，随血液循环运行至全身，因此艾叶及艾燃烧生成物可能是通过其中的挥发油的芳香作用达到加快血液循环，通络散疾的作用[25]。

从中医理论角度来讲，中医学认为饮食劳倦，七情内伤，素体虚弱，寒邪凝滞等因素导致心脏的气滞血瘀、阴阳失调而成动脉硬化性心脑血管疾病，艾灸以其活血化瘀、温阳补虚的优势被广泛推广应用到心脑血管疾病的防治中。用艾灸可活血化瘀，温散寒邪，人体的正常生命活动有赖于气血的作用，气行则血行，气止则血止，血气在经脉中流行，完全是由于“气”的推动。各种原因，如“寒则气收，热则气疾”等，都可影响血气的流行，变生百病。而气温则血滑，气寒则血湿，也就是说，气血的运行有遇温则散，遇寒则凝的特点。所以朱丹溪说:“血见热则行，见寒则凝”。因此，凡是一切气血凝湿，没有热象的疾病，都可用温气的方法来进行治疗。《灵枢·刺节真邪》篇中说:“脉中之血，凝而留止，弗之火调，弗能取之”。《灵枢·禁服》亦云:“陷下者，脉血结于中，血寒，故宜灸之”。灸法正是应用其温热刺激，起到温经通络的作用。通过热灸对经络穴位的温热性刺激，可以温经散寒，加强机体气血运行，达到临床治疗目的。同时，血栓的形成主要是由于“气滞血凝”“凝血瘀者”或者“痰瘀血凝”，由于人体功能下降，或者情志不遂、过食肉食肥甘厚腻、使肝郁气滞、脾虚痰湿内生或者寒凝阻碍气血运行，形成瘀血，日久可瘀阻脉络形成心脑血管疾病。艾灸可以活血化疾，温阳补虚，消瘀散结，鼓动阳气，推动血液的运行，因此血液流速加快，使瘀滞消散，从而防止血栓的形成。

6　结论

艾灸对凝血-纤溶系统有良好的调节作用，可以通过下调PAI-1的含量，提高纤溶系统的活性，上调6-Keto-PGF1α/TXB2的比值，降低黏附因子VWF，进一步发挥其调控血小板活化，防治动脉硬化的效应。

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(2016-06-28收稿责任编辑：洪志强)

Observation on the Effect of Moxibustion on Fibrinolytic Clotting Factors of Apolipoprotein E-deficient Arteriosclerosis Mice

Yang Jia, Zhao Baixiao, Ha Lue, Huang Chang, He Rui

(SchoolofAcupuncture-moxibustionandTuinaofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the regulating effect of moxibustion on fibrinolytic clotting factors in apolipoprotein E-deficient (ApoE-/-) arteriosclerosis (AS) mice. Methods: ApoE-/-AS mice were randomly divided in to model group, moxibustion group and clopidogrel group, with 15 mice in each, and fed with high fat. In addtion, 15 C57BL/6 mice were chosen as the normal control group, fed with normal diet. The normal control group and model group were both only given fixation to mice without any treatment, 20 min/day. Moxibustion group was given moxibustion on Dan Zhong (CV17) acu-point 20 min/day. Besides, the clopidogrel group was given clopidogrel 14 mg/kg. After 16 weeks of intervention (6 days/week), mice were killed to take the heart blood as to test the level of t-PA and PIA-1 using ELISA method. Also, the expression of TXB2，6-Keto-PGF1a and vWF were tested. Results: Comparing with the model group, t-PA and TXB2 in the moxibusiton group was enhanced with no statistical significance (P>0.05), while the PAI-1 and vWF were decreased significantly (P<0.05). Conclusion: Moxibustion can regulate fibrinolytic clotting factors positively by down-regulating PAI-1 and activate fibrinolytic system, up-regulating 6-Keto-PGF1α/ TXB2, decreasing vWF thus activating thrombocyte and preventing AS.

Moxibustion; Arteriosclerosis; Fibrinolytic clotting system

国家自然科学基金项目(编号：81373730)；国家自然科学基金项目(编号：81574068)；国家青年自然基金项目(编号：81403449)；国家国际科技合作专项项目(编号：2011DFA31370)

杨佳，女，北京中医药大学针灸推拿学院2013级博士，E-mail：yangjia902@126.com

赵百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生导师，北京中医药大学针灸推拿学院院长，研究方向：艾灸作用与原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.006