liguzinediol基于肌浆网钙泵促进钙释放发挥正性肌力作用

王 伟，李 莎，张梦丹，高 颖，薛书银，陈可塑，王中越，陈 龙，（.南京中医药大学药学院国家科技部规范化中药药理实验室，江苏南京 0046；.南京军区总医院干部病房呼吸科，江苏南京 000；.泰州中国医药城中医药研究院，江苏泰州 500）

·论著·

liguzinediol基于肌浆网钙泵促进钙释放发挥正性肌力作用

王 伟1，李 莎1，张梦丹1，高 颖1，薛书银1，陈可塑2，王中越3，陈 龙1，3
（1.南京中医药大学药学院国家科技部规范化中药药理实验室，江苏南京 210046；2.南京军区总医院干部病房呼吸科，江苏南京 210002；3.泰州中国医药城中医药研究院，江苏泰州 225300）

目的 研究liguzinediol（LZDO）正性肌力动力学特点及其作用机制。方法 ①大鼠在体实验，经左侧颈外静脉缓慢推注LZDO 20 mg·kg-1，连续记录30 min左心室压力-容积环。②采用大鼠离体心脏，分别灌流咖啡因0.5 mmol·L-1以及咖啡因0.5 mmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1，记录其左心室收缩力。③心肌细胞钙释放实验，分别灌流毒胡萝卜素2 μmol·L-1以及毒胡萝卜素2 μmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1，记录其肌浆网钙释放。④采用灌流后的心脏，分离肌浆网膜蛋白之后，测定LZDO（1，10和100 μmol·L-1）对肌浆网钙转运ATP酶（SERCA2a）活性作用。结果 ①除心率及舒张末期容积外，LZDO 20 mg·kg-1显著减少收缩末期容积，显著增加收缩末期压力、每搏输出量、射血分数、心输出量、左室压力最大上升速率及搏出功（P＜0.05）。②咖啡因0.5 mmol·L-1灌流5 min，大鼠离体心脏心率、左心室发展压及左心室内压最大上升速率增加，灌流30 min后各指标均降低。而LZDO 100 μmol·L-1则能对抗咖啡因0.5 mmol·L-130 min的这种降低作用（P＜0.05）。③毒胡萝卜素2 μmol·L-1显著降低心肌细胞钙释放，从标准化的正常灌流液组（100±5）%降低到（51±5）%（P＜0.05），而LZDO 100 μmol·L-1未能对抗毒胡萝卜素的作用〔（49± 4）%〕。④LZDO（10和100 μmol·L-1）显著增加心肌肌浆网钙泵活性，从正常灌流液组0.98±0.10分别增加到1.17±0.20及（1.43±0.09）μmol Pi·g-1·h-1，呈现浓度依赖性（r=0.85，P＜0.05）。结论 LZDO通过增加钙泵活性提高肌浆网钙浓度梯度，从而间接增加钙释放而发挥正性肌力作用。基于其作用机制，LZDO有可能被开发为临床上使用的正性肌力药物。

liguzinediol；钙释放；强心药；肌浆网钙转运ATP酶类

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.003

Liguzinediol（LZDO）化学名为2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪，是川芎嗪（ligustrazine）的一种衍生物。由于其对位二羟基的结构，LZDO呈现出了对离体及在体心脏的正性肌力作用［1-3］。基于这种作用，LZDO获得了中国（授权专利号：CN101361740B）及美国专利（授权专利号：US 8158630B2）。

我们前期研究表明，在一系列川芎嗪衍生化合物中，LZDO呈现出了良好的正性肌力活性［4］，其作用靶点可能为钙泵［1］。基于其正性肌力的药理作用，LZDO能增强多柔比星模型大鼠下降的心肌收缩力［2］。此外，在大鼠体内LZDO呈现出了良好的代谢特点，水溶性高，生物利用度达95%［5］。然而先前的研究并未阐明LZDO对整体大鼠心肌收缩力作用的动力学特点，及作用靶点的直接证据。本研究在前期研究的基础上，研究LZDO对在体大鼠心脏左心室压力-容积环的影响，分析在其作用下大鼠左心室压力与容积的关系；探索LZDO与钙泵及肌浆网钙释放的关系，进一步确证其作用靶点。

1　材料与方法

1.1试剂和主要仪器

自制LZDO（纯度为99.5%）；咖啡因，毒胡萝卜素及其他试剂均购自美国Sigma-Aldrich公司。PowerLab多导生理记录仪（澳大利亚 AD Instruments；型号：PowerLab 8/35），Millar放大器（美国MILLAR公司，型号：735-2083 Rev.F），心室内压和压力容积导管（美国MILLAR公司，型号：大鼠SPR-901）。Zeiss LSM 710（德国卡尔蔡司公司）倒置共聚焦显微镜系统。试剂盒由南京建成生物有限公司提供。

1.2在体大鼠左心室压力-容积关系曲线记录

健康清洁级雄性SD大鼠，体质量250～300 g，由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（苏）2007-0008。ip给予20%乌拉坦5 mL·kg-1，在麻醉状态下分离右侧颈总动脉及左侧颈外静脉，定标压力-容积导管压力。LZDO （20 mg·kg-1）溶于0.1 mL生理盐水经左侧颈外静脉缓慢推注，连续记录LZDO作用30 min。实验结束后用30%盐水及自身血液进行体积定标。实验结果用AD Instruments的Labchart 8软件分析，指标包括：心率（heart rate，HR）、收缩末期容积（end-systolic volume，Ves）、舒张末期容积（enddiastolic volume，Ved）、收缩末期压力（endsystolic pressure，Pes）、每搏输出量（stroke volume，SV）、射血分数（ejection fraction，EF）、心输出量（cardiac output，CO）、左心室压力最大上升速率 （peak rate of rise of left ventricular pressure，+dp/dtmax）及搏出功（stroke work，SW）。预实验表明，单独0.1 mL生理盐水经左侧颈外静脉缓慢推注不影响大鼠上述左心室压力-容积关系动力学参数（n＞20）。

1.3离体大鼠左心室收缩力记录

采用的大鼠及麻醉的方式同在体实验，实验方法同前［3］。采用Langendorff装置，充氧（95%O2+ 5%CO2）条件下，离体心脏灌流（mmol·L-1：NaCl 117，KCl 5.7，CaCl21.8，MgCl21.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，HEPES 20，葡萄糖11），用NaOH调pH至7.4，温度为（37.5±0.5）℃，灌流压80 cm H2O（1 cmH2O=0.098 kPa）。将压力感受器探头经左心房插入左心室，经压力换能器与RM6240型多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂）相连用于记录左心室收缩曲线。咖啡因0.5 mmol·L-1灌流持续30 min，分别记录5 min及30 min时的作用。随后共同灌流咖啡因0.5 mmol·L-1和LZDO 100 μmol·L-110 min，并记录心率HR、左心室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）、左心室内压最大上升速率+dp/dtmax的变化。

1.4激光共聚焦测定左心室心肌细胞钙释放

实验方法同我们前期研究［3］。分离大鼠左心室心肌细胞，在37℃条件下与Fluo-3（5 μmol·L-1，上海东仁化学科技有限公司）共同孵育30 min，加载好荧光染料的细胞置于倒置共聚焦显微镜系统的载物台上。以0.5 Hz及1.5倍阈强度（～10 V）的局部场脉冲刺激细胞。共聚焦显微镜的成像方式为线扫描，采样速率为2 ms/线，共聚焦线扫描在局部场刺激开始前200 ms开始，起始部分作为刺激前的本底对照。实验获得图像用IDL（Research Systems，Boulder，CO）程序处理，钙瞬变的大小以标准荧光强度F/F0表示，其中F0表示静息状态的荧光强度。

1.5心肌肌浆网钙泵活性测定

采用心脏灌流的方法（同1.3法），LZDO（0，1，10，100 μmol·L-1）灌注离体心脏10 min后，快速剪取离体心脏左心室心肌组织，称重，液氮中研碎后按10 mL·g-1的比例加入匀浆液（mmol·L-1：NaHCO310，NaN35，Tris∙HCl 15，pH 6.8）进行匀浆，并在8289×g条件下离心20 min去除细胞碎片，取上清液32 300×g离心45 min，将沉淀混悬于缓冲液（mmol·L-1：KCl 600，Tris∙HCl 10，pH 6.8）中，再次32 300×g离心45 min，沉淀即为肌浆网膜，混悬于的缓冲液（mmol·L-1：蔗糖250，组氨酸10）中［6］。用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。根据超微量Ca2+-ATP酶测定说明书分酶促反应和定磷反应2步测定肌浆网钙转运ATP酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA2a）活性。

1.6统计学分析

2　结果

2.1LZDO对大鼠左心室收缩动力学的作用

图1为大鼠静脉注射LZDO 20 mg·kg-1前后代表性的左心室压力-容积环，表明LZDO增加左心室收缩压、舒张期末期容积、做功面积。表1中数据显示，除HR及Ved外，Ves容积显著减少，Pes，SV，EF，CO，+dp/dtmax及SW显著增加（P＜0.05）。

2.2LZDO对抗咖啡因引起的收缩力下降的作用

图2为咖啡因及LZDO灌流前后，大鼠离体心脏左心室收缩力变化的代表性曲线。表2表明，咖啡因0.5 mmol·L-1作用5 min后，HR，LVDP 和+dp/dtmax均增加，30 min后均降低（P＜0.05）。而LZDO 100 μmol·L-1能对抗咖啡因0.5 mmol·L-130 min引起的收缩力减弱（P＜0.05），提示LZDO能对抗咖啡因耗竭心肌肌浆网钙浓度的作用。

Fig.1 Representative recording of steady-state left ventricular pressure-volume（P-V）loops before and after administration of liguzinediol（LZDO）20 mg·kg-1in rats.

Tab.1 Effect of LZDO on kinetic parameters of left ven⁃tricular contractility before and after administration of LZDO 20 mg·kg-1in rats

Fig.2 Representative traces of contractility from rat left ventricles before and after administration of caffeine and LZDO in isolated rat hearts.Caffeine 0.5 mmol·L-1（up to 30 min）and caffeine 0.5 mmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1were perfused sequentially.

Tab.2 Effect of LZDO on contractility of left ventricles in isolated rat hearts

2.3LZDO对大鼠左心室心肌细胞钙释放的影响

我们先前的研究表明，LZDO 100 μmol·L-1自灌流2 min开始明显增加大鼠左心室心肌细胞的钙释放，作用持续到30 min时钙释放从标准化正常灌流液组（100±4）%增加到（138±7）%及（139±12）% （P＜0.05，n=5）［3］。本次实验发现，钙泵抑制剂毒胡萝卜素明显抑制钙释放，从标准化的正常灌流液组（?100±5）%降低到（51±5）%（P＜0.05，n=4）。其抑制作用于30 min后达到稳定（图3）。LZDO 100 μmol·L-1灌流5 min后未能对抗毒胡萝卜素抑制钙释放的作用。

2.4LZDO对肌浆网钙泵活性的作用

LZDO（0，1，10和100 μmol·L-1）灌注离体心脏后，表3结果显示LZDO 10和100 μmol·L-1处理过心脏的肌浆网膜中SERCA2a酶活性呈现浓度依赖性的增加（r=0.83，P＜0.05）。

Tab.3 Effect of LZDO on activities of sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase（SERCA2a）of left ventricular myocytes from isolated rat hearts

3　讨论

本研究发现，LZDO在整体大鼠的正性肌力作用的特点，LZDO不仅增加左心室压力，而且减少收缩期心室的残留量提高心脏的EF，在HR不变的条件下实现CO的增加；LZDO增加肌浆网钙释放，是通过增加肌浆网钙泵活性。虽然先前的研究推测LZDO发挥正性肌力作用可能基于增加肌浆网钙泵活性，但缺少直接证据［1-2］。本研究通过兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyR）激动剂咖啡因灌流实验，显示LZDO具有对抗咖啡因的肌浆网钙耗竭作用，间接证明LZDO具有增加肌浆网钙浓度梯度的作用。并通过钙泵抑制剂毒胡萝卜素，证明了LZDO促进肌浆网钙释放被毒胡萝卜素所阻断，间接证明LZDO的作用靶点为钙泵。而通过测定钙泵活性，获得了LZDO具有促进钙泵活性的直接证据。

钙诱导性钙释放（Ca2+induced Ca2+release， CICR）是心肌细胞收缩的触发点，L型钙通道开放导致少量的钙离子从细胞外进入细胞内，引起肌浆网上的RyR开放，称为CICR［7-8］。大量的钙进入胞浆引起心肌收缩，与此同时钙泵将钙从胞浆泵入肌浆网并导致心肌舒张［9-10］。咖啡因能引起RyR持续大量开放，起初引起胞浆钙浓度急剧增加，随之因耗竭肌浆网内的钙而导致钙释放下降。毒胡萝卜素能抑制钙泵活性，阻止钙从胞浆泵入肌浆网，使肌浆网的钙浓度下降。LZDO通过提高钙泵活性增加肌浆网钙的浓度，间接增加钙释放。

然而，钙泵受到受磷蛋白（phospholamban，PLB）的调控，磷酸化的PLB解除对钙泵的抑制作用，而去磷酸化PLB对钙泵具有抑制作用［11］。蛋白激酶A及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ磷酸化PLB，而蛋白磷酸酶使PLB去磷酸化。因此，本研究还无法确定LZDO是直接激活钙泵，还是通过其他途径（如蛋白激酶A、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ及蛋白磷酸酶）发挥正性肌力作用。更详细的作用靶点的确定需进一步研究。

临床上用于心衰的药物有利尿药［12］、β肾上腺素受体拮抗药［13］、心脏正性肌力药［14］、血管紧张素转换酶抑制剂［15］、血管紧张素受体阻断剂和醛固酮拮抗药［16］等，而临床心脏正性肌力药物为强心苷类、磷酸二酯酶抑制剂类及多巴胺。由于严重的不良反应，心脏正性肌力药只有强心苷类常用于临床。即使被认为是较为安全的强心苷类，临床上仍然容易导致心律失常［17］。LZDO发挥心脏正性肌力的靶点为钙泵，与目前临床使用的正性肌力的靶点不同，而且高浓度条件下不易产生心律失常［3］，可作为具有潜力的抗心衰药物进行深入研究。

［1］Chen L，Xu Y，Li W，Wu H，Luo Z，Li X，et al. The novel compound liguzinediol exerts positive inotropic effects in isolated rat heart via sarcoplas⁃mic reticulum Ca2+ATPase-dependent mechanism ［J］.Life Sci，2012，91（11-12）：402-408.

［2］Li Y，Song P，Zhu Q，Yin QY，Ji JW，Li W，et al. Liguzinediol improved the heart function and inhibited myocardial cell apoptosis in rats with heart failure ［J］.Acta Pharmacol Sin，2014，35（10）：1257-1264.

［3］Xu Y，Luo ZK，Liu QM，Huang FF，Li XH，Liu L，et al.Positive inotropic mechanism of liguzinediol and heart safety evaluation［J］.Chin J Pharmacol Toxico（l中国药理学与毒理学杂志），2012，26（2）：151-156.

［4］Liu Z，Li W，Wen HM，Bian HM，Zhang J，Chen L，et al.Synthesis，biological evaluation，and phar⁃macokinetic study of novel liguzinediol prodrugs ［J］.Molecules，2013，18（4）：4561-4572.

［5］Liu Z，Li W，Qin K，Wen K，Zhu CJ，Li NG，et al. Scaffold evaluation of liguzinediol analogs as novel cardiotonic agents［J］.Pharmazie，2013，68（12）：926-932.

［6］Osada M，Netticadan T，Tamura K，Dhalla NS. Modification of ischemia-reperfusion-induced changes in cardiac sarcoplasmic reticulum by preconditioning ［J］.Am J Physiol，1998，274（6 Pt 2）：H2025-H2034.

［7］Blatter LA，Kockskämper J，Sheehan KA，Zima AV，Hüser J，Lipsius SL.Local calcium gradients during excitation-contraction coupling and alternans in atrial myocytes［J］.J Physiol，2003，546（Pt 1）：19-31.

［8］Chen-Izu Y.Multiple levels of the single L-type Ca2+channel conductance in adult mammalian ventricular myocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（1）：604-608.

［9］Cornea RL，Autry JM，Chen Z，Jones LR.Reex⁃amination of the role of the leucine/isoleucine zipper residues of phospholamban in inhibition of the Ca2+pump of cardiac sarcoplasmic reticulum［J］. J Biol Chem，2000，275（52）：41487-41494.

［10］Kranias EG，Hajjar RJ.Modulationofcardiac contractility by the phospholamban/SERCA2a regu⁃latome［J］.Circ Res，2012，110（12）：1646-1660.

［11］Vittone L，Mundina-Weilenmann C，Mattiazzi A. Phospholamban phosphorylation by CaMKⅡ under pathophysiological conditions［J］.Front Biosci，2008，13：5988-6005.

［12］Azad N，Lemay G.Management of chronic heart failure in the older population［J］.J Geriatr Cardiol，2014，11（4）：329-337.

［13］Dobre D，Van Veldhuisen DJ，Dejongste MJ，Lucas C，Cleuren G，Sanderman R，et al.Pre⁃scription of beta-blockers in patients with advanced heart failure and preserved left ventricular ejection fraction.Clinical implications and survival［J］.Eur J Heart Fail，2007，9（3）：280-286.

［14］Flather MD，Yusuf S，Køber L，Pfeffer M，Hall A，Murray G，et al.Long-term ACE-inhibitor therapy in patients with heart failure or left-ventricular dysfunction：a systematic overview of data from individual patients.ACE-Inhibitor Myocardial Infarction Collaborative Group［J］.Lancet，2000，355（9215）：1575-1581.

［15］Pitt B，Zannad F，emme WJ，Cody R，Castaigne A，Perez A，et al.The effect of spironolactone on morbidity and mortality in patients with severe heart failure.Randomized Aldactone Evaluation Study Investigators［J］.N Engl J Med，1999，341 （10）：709-717.

［16］Rich MW，Mcsherry F，Williford W，Yusuf S.Digitalis Investigation Group.Effect of age on mortality，hospitalizations and response to digoxin in patients with heart failure：the DIG study［J］.J Am Coll Cardiol，2001，38（3）：806-813.

［17］Gjesdal K，Feyzi J，Olsson SB.Digitalis：a dangerous drug in atrial fibrillation？An analysis of the SPORTIFⅢandⅤdata［J］.Heart，2008，94（2）：191-196.

Liguzinediol exerts positive inotropic effect by enhancing Ca2+release from sarcoplasmic reticulum mediated by sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase

WANG Wei1，LI Sha1，ZHANG Meng-dan1，GAO Ying1，XUE Shu-yin1，CHEN Ke-su2，WANG Zhong-yue3，CHEN Long1，3
（1.National Standard Laboratory of Pharmacology for Chinese Materia Medica，School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China；2.Department of Respiratory Disease，Inpatient Wards for Senior Cadres，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing 210002，China；3.Institute of Chinese Medicine of Taizhou China Medical City，Taizhou 225300，China）

OBJECTlVE To explore kinetic features and its underlying mechanism of the positiveinotropic effect of liguzinediol（LZDO）in rats.METHODS①An In vivo study was made to record the effect of LZDO 20 mg·kg-1injected for 30 consecutive min from the left external jugular vein on pressurevolume relationships.②Ex vivo study was used to record the antagonistic effect of LZDO on reduced contractility induced by caffeine.Caffeine and LZDO were perfused as follows：normal perfusion solution，caffeine 0.5 mmol·L-1，and then caffeine 0.5 mmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1.③ Ca2+transient from cardiomyocyte sarcoplasmic reticulum（SR）was measured to analyze the effect of LZDO on Ca2+release blocked by thapsigargin.Thapsigargin and LZDO were perfused as follows：normal perfusion solution，thapsigargin 2 μmol·L-1，and then thapsigargin 2 μmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1. ④The SR vesicles were prepared and the effect of LZDO（1，10 and 100 μmol·L-1）on sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase（SERCA2a）activity was determined according to the ultramicro-Ca2+-ATP enzyme kit.RESULTS① LZDO 20 mg·kg-1significantly reducedtheend-systolicvolume（Ves）and enhanced the end-systolic pressure（Pes），stroke volume（SV），ejection fraction（EF），cardiac output（CO），peak rate of rise of left ventricular pressure（+dp/dtmax）and stroke work（SW）（P＜0.05）. However，LZDO 20 mg·kg-1did not significantly change the heart rate（HR）or the end-diastolic volume （Ved）.② Caffeine 0.5 mmol·L-1significantly enhanced HR，left ventricular developed pressure （LVDP），and+dp∶dtmaxat 5 min after caffeine and decreased at 30 min.However，LZDO 100 μmol·L-1restored the reduced HR，LVDP，and+dp/dtmaxinduced by caffeine at 30 min（P＜0.05）.③Thapsigargin 2 μmol·L-1significantly reduced the SR Ca2+transient from perfusion solution group（100±5）%to（51± 5）%（P＜0.05）and LZDO 100 μmol·L-1failed to restore the decreased Ca2+transient〔（49±4）%〕. Normalized Ca2+transients were reduced by thapsigargin 2 μmol·L-1and thapsigargin 2 μmol·L-1+LZDO 100 μmol·L-1.④ LZDO（10 and 100 μmol·L-1）significantly increased the activities of SERCA2a in perfusion solution group 0.98±0.10 to 1.17±0.20 and（1.43±0.09）μmol Pi·g-1·h-1，respectively（P＜0.05）.CONCLUSlON LZDO can enhance SR Ca2+gradient by activating the SERCA2a and might be developed to serve as a potential positive inotropic agent in clinical settings.

liguzinediol；Ca2+release；cardiotonic agents；sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase

The project supported by Natural Science Foundation for High Education of Jiangsu Province （14KJA360002）；and Natural Science Foundation of Jiangsu Province（BK20131262）

CHEN Long，E-mail：longchen@njutcm.edu.cn，Tel：（025）85811193，13584058521

R972，R285.5

A

1000-3002-（2016）03-0197-06

2015-12-01接受日期：2016-02-20）

（本文编辑：乔 虹）

江苏省自然科学基金（BK20131262）；江苏省高校自然科学研究重大项目（14KJA360002）

王 伟，男，硕士研究生，主要从事药物正性肌力机制研究，E-mail：631897525@qq.com，Tel：（025）85811193，15105107024

陈 龙，E-mail：longchen@njutcm.edu.cn，Tel：（025）85811193，13584058521，