基于NMR技术的溶菌酶在琼脂糖凝胶中的动力学研究

邹亚娟,代博娜

(上海交通大学 分析测试中心，上海　200240)



研究报告(069～073)

基于NMR技术的溶菌酶在琼脂糖凝胶中的动力学研究

邹亚娟,代博娜

(上海交通大学 分析测试中心，上海200240)

运用脉冲梯度场测量自扩散系数及自旋自旋弛豫时间测量核磁共振技术对鸡蛋清溶菌酶(HEWL)在琼脂糖凝胶中的动力学进行了研究.试验结果表明，HEWL在琼脂糖凝胶中的自扩散系数及自旋自旋弛豫时间较其在纯乙酸钠溶液中变小，说明琼脂糖凝胶的三维网状结构使HEWL分子整体运动及局部运动都受到阻碍. 并且随着琼脂糖浓度的增大，凝胶网孔尺寸不断减小，HEWL分子运动受限程度加剧，从而蛋白质分子可以较长时间内停留在高浓度区，分子间更容易互相碰撞，发生反应，晶核生长得以促进. 同时琼脂糖凝胶较小流体力学网孔尺寸抑制聚晶或沉淀的出现，晶体质量获得提高.

琼脂糖凝胶；核磁共振；溶菌酶；蛋白质结晶

溶菌酶又称胞壁质酶，是由129个氨基酸组成的一种无毒且具有一定溶菌作用的碱性球蛋白，可溶于水和酸性溶液，耐热, 在pH 4～7的范围内, 100 ℃处理1 min仍有近100%的活力，在食品、医学、生物工程等多种领域中用途非常广泛，目前实际应用和已商品化的是鸡蛋清溶菌酶(HEWL)[1-4]. 在结晶蛋白中，溶菌酶是一种模型蛋白，1946年，四方晶系蛋清溶菌酶单晶首次由Alderton获得，随后其结晶条件被继续深入研究. 到20世纪80年代初时，人们已经对溶菌酶结晶与温度、pH值、NaCl浓度等反应条件之间的关系有了一个初步的较完整的研究结果. 然而，溶菌酶结晶目前仍属于科学者非常感兴趣的领域，被越来越广泛地研究.

琼脂糖凝胶因为可以促进晶核形成、抑制堆积效应已经被应用于蛋白结晶研究[5]. 研究者发现，琼脂多糖的浓度对蛋白晶体的形成有巨大的影响，但是，目前对其作用机理研究得还是不够透彻.

核磁共振(NMR)波谱的许多参数，如化学位移、纵向(T1)、横向(T2)弛豫时间和自扩散系数(D)等，与原子核所处的化学环境及其运动状态密切相关. 通过测量这些参数，可以获得体系中的各种信息. 对蛋白质分子的NMR弛豫行为进行研究，是了解蛋白质运动特性的有效手段之一[6]. 蛋白质分子在溶液中的整体转动和内运动，使得局部磁场的空间取向随时间不断发生改变，作用于原子核从而产生自旋弛豫现象. 由于局部磁场随时间的随机涨落对分子内运动非常敏感，所以可以利用弛豫参数这一内在探针来探测蛋白质的动力学性质，因而NMR核自旋弛豫实验成为蛋白质动力学研究最直接、也最广泛使用的方法.

分子自扩散系数的大小与分子的结构和所处的介质有关，测定自扩散系数可以表征分子运动状态，以及与分子运动状态有关的一些物理和化学变化，如分子的聚集状态、分子间的相互作用、溶液的粘度、温度等. 因此通过测量分子的自扩散系数，可以研究分子间的相互作用，聚集状态等问题[7]. 测量分子自扩散系数的方法有重量法、膜渗透法、荧光法和动态光散射法等. 这些研究方法都提供了有关高分子形态和结构的相关信息以及迁移现象，而脉冲梯度(PFG)NMR测量自扩散系数技术对样品的溶剂无选择性、对样品无损害，并且随着NMR仪器硬件的逐渐发展、脉冲梯度场强度逐渐提高以及脉冲序列的不断更新，PFG NMR可以检测的高分子分子量范围逐渐扩大，其实际应用价值不断提高.

本文应用NMR方法，对溶菌酶在琼脂糖凝胶中的动力学进行了评价，以探讨琼脂糖凝胶对溶菌酶结晶的影响.

1　试验部分

1.1仪器与试剂

Bruker Avance II 400WB超导核磁共振波谱仪及Bruker DIFF-60自扩散探头.

琼脂多糖(Sea plaque，Mw=2.422 × 105，Lonza公司，catalogue No. F5170A)；鸡蛋清溶菌酶(HEWL，Mw=14k Da，DaSeikagaku公司，catalogue No. 100940)；

重水(Aldrich公司，氘代度99.9%，catalogue No. 151882)；

乙酸钠(AR，Aladdin公司，catalogue No. 127-09-3).

1.2NMR样品制备

将琼脂糖粉末分散在重水里，室温下搅拌2 h，然后在85 ℃下加热1 h直至样品完全溶解，制备质量分数为1.2%～6.0%的琼脂多糖溶液，将鸡蛋溶菌酶粉末溶解在0.3 mol/L的乙酸钠溶液(pH 4.5)里，鸡蛋溶菌酶的质量浓度为150 mg/mL. 将琼脂多糖溶液、鸡蛋溶菌酶溶液及纯净水按体积比1∶1∶1，在55 ℃充分混合，迅速转移到预热过的直径为10 mm的核磁管内，然后将核磁管放在4 ℃冰箱里保持1 h，最终所制备的样品中琼脂糖的质量分数为0.0%～2.0%，鸡蛋溶菌酶的质量浓度为50 mg/mL，乙酸钠的浓度为0.1 mol/L.

1.3NMR测试

溶液NMR试验采用BrukerAvance II 400WB核磁共振波谱仪，其1H的共振频率为400.13 MHz，梯度场处于z方向上. 试验所用脉冲序列为STE和 CPMG-spin-echo (SE)，如图1所示.

扩散试验梯度场强度从700 gauss/cm逐步(分8次)等间隔递增到1 300 gauss/cm，扩散时间设置为5 ms. 横向弛豫时间T2测量时τ设为2 ms，n的list为：1、3、5、7、9、11、13、15，扩散时间设为5 ms.1H的90度脉冲的宽度为16 μs，弛豫延迟时间为5 s，采样次数为32，采样点数为8 192. 试验采用的温控系统为BVT 3200，样品实际温度由放置在核磁管中的光纤温度计(Takaoka Electric Manufacturing Co.)测定，如图2所示，温控误差为±0.1 K. 试验温度为25 ℃，在样品放入磁体中恒温30 min后开始采样. 自扩散系数由以式(1)计算[8-9]：

I(g) =I(0) exp[-γ2g2Dδ2(Δ -δ/3)]

(1)

其中,I(g)和I(0)分别为t= 2τ2+τ1梯度脉冲存在及梯度脉冲为零时1H的信号强度，γ为1H的磁旋比，脉冲梯度场宽度δ为1 ms.1H化学位移以HDO质子信号(25 ℃，相对于DSS为δ4.70)为标准设定.

2　结果与讨论

2.1HEWL在乙酸钠溶液及琼脂糖凝胶中的自扩散系数

HEWL在0.1 mol/L乙酸钠溶液及质量分数为0.4%～2.0%的琼脂糖凝胶中，自扩散系数从PFG-STE1H NMR试验求得. 图3(a)、(b)分别为HEWL在0.1 mol/L乙酸钠溶液及质量分数为1.6%琼脂糖凝胶中的PFG-STE1H核磁共振试验堆积谱图. 由图3可见，分子扩散运动引起NMR信号强度的衰减，与梯度脉冲的脉宽δ、强度g及分子的自扩散系数D有关. 我们将脉冲梯度场的强度从700 gauss/cm开始等间隔递增，记录一系列相应的1D1H NMR谱，然后对化学位移8.0～12.0 ppm的HEWL的谱峰进行积分. 样品中所含小分子的信号由于其自身的快速自扩散运动而衰减为零.

图4为所选积分区域的试验数据以γ2g2δ2(Δ -δ/3)对积分强度的自然对数值作图. 由图4可以看出，随着琼脂糖浓度的增加，曲线的斜率变小. 尽管HEWL的分子量分布存在一定的范围，但所用样品在所有时刻的试验数据都是呈线性分布的. 因此，我们根据式(1)，按单指数进行拟合，得到HEWL的平均自扩散系数值D. 在纯乙酸钠溶液中，HEWL自扩散运动最快；而在琼脂糖凝胶中，随着琼脂糖浓度的增加，DHEWL逐渐减小.

质量分数为1%～2%琼脂糖溶液的凝胶转变温度在40 ℃附近[10]. 在样品温度骤降到凝胶转变温度以下时，琼脂糖多糖分子会经历从无序的无归线团到有序的双螺旋的构象转换，而后于分子链之间产生氢键作用和分子缠结，形成交联点，最终形成聚合物网状结构(如图5所示). 琼脂糖浓度越大，形成的凝胶网孔尺寸越小. 很多试验证明，蛋白质结晶的首要条件是达到过饱和，因而结晶母液需保持较高的蛋白质浓度. 浓度较高时，由于蛋白分子本身扩散速率较低，因而分子间更易相互碰撞，发生反应. 但浓度过高，蛋白分子析出结晶的速度大大加快，远远快于其形成晶核的速度，最终只能得到一些无定形固体微粒而得不到晶体. 在纯乙酸钠溶液中，HEWL分子均匀地分布在溶液的整个空间内(如图5所示). 而在琼脂糖凝胶中，HEWL分子穿梭分布于三维网状结构中，使得蛋白质分子的局部浓度提高，分子自扩散运动较其在水相中受限. 并且随着琼脂糖浓度的增加，琼脂糖凝胶网孔尺寸减小，其自扩散运动受限程度加剧，从图6(a)可以看到，相对于在水相中，HEWL在不同浓度琼脂糖凝胶中的自扩散系数降低到原来的40%～80%，这使得蛋白质分子可以在较长时间内停留在高浓度区，从而蛋白质分子间更容易互相碰撞，发生反应，促进晶核生长，生成高质量晶体.

过饱和的蛋白质溶液可以经过热力学诱导而分离成两个介稳的浓度相差较大的液相. 在蛋白质浓度较高的液相区，生长速率相对过快，可能会导致产生不同形式的沉淀物或聚晶. 据研究发现，质量分数为2.1% 琼脂糖凝胶的流体力学网孔尺寸在25 nm左右[10]. 在蛋白质成长为聚晶后，因为它较单体流体力学半径会变大，将更难穿梭于流体力学网孔尺寸为25 nm左右的琼脂糖凝胶的三维网状结构里，与其它分子间碰撞的几率大大降低，也就从某种程度上降低了蛋白质生成聚晶的速率. 除此之外，在琼脂糖凝胶中，空穴现象大大被削弱，十分有利于晶核的成长.

2.2HEWL在乙酸钠溶液及琼脂糖凝胶中的自旋自旋弛豫时间

蛋白质分子在溶液或凝胶中的运动分为整体和内运动. 前面探讨的HEWL分子的自扩散运动属于整体运动. 分子内运动又进一步分为ps～ns时间尺度的快运动和μs～ms时间尺度的慢构象交换运动. 前者包括了分子内化学键的振动、摆动以及侧链的转动等，后者则与配体结合、酶催化、蛋白质折叠、变构等重要生化事件发生在同一时间尺度内. 我们通过经自旋回波及梯度脉冲修饰后的CPMG脉冲序列成功过滤掉样品中小分子的信号，测量了水相及琼脂糖凝胶中HEWL1H的自旋自旋弛豫时间T2，结果如图6(b)所示. 由图6可以看出，随着琼脂糖凝胶的出现及琼脂糖浓度的增加，T2不断减小，说明HEWL分子构象交换运动变缓，局部运动能力下降，这更有利于晶核生成，晶体成长.

3　结论

脉冲梯度场测量自扩散系数及自旋自旋弛豫时间测量核磁共振试验结果表明：

(1)HEWL在不同浓度的琼脂糖凝胶中，5 ms的扩散时间内，自扩散系数以单组份存在；

(2)HEWL在琼脂糖凝胶中的自扩散系数及自旋自旋弛豫时间较其在纯乙酸钠溶液中变小，说明HEWL分子整体运动和局部运动受到琼脂糖凝胶的三维网状结构的阻碍；

(3)随着琼脂糖浓度的增大，凝胶网孔尺寸减小，HEWL分子运动受限程度加剧，使得蛋白质分子的局部浓度提高，HEWL分子可以在较长时间内停留在高浓度区，从而蛋白质分子间更容易互相碰撞，发生反应，促进晶核生长. 同时琼脂糖凝胶较小的流体力学网孔尺寸抑制聚晶或沉淀的出现，从而生成高质量晶体.

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NMR Studies on Molecular Mobility of Protein of Hen Egg White Lysome in Agarose Gels

ZOU Ya-juan, DAI Bo-na

(InstrumentalAnalysisCenter，ShanghaiJiaoTongUniversity，Shanghai200240，China)

Changes in the molecular mobility of hen egg white lysome(HEWL)in aqueous solution and in agarose gel were measured by pulsed-field-gradient stimulated echo (PFG-STE)1H NMR and spin-spin relaxation time(T2)1H NMR methods in order to elucidate the effect of agarose gel on the crystallization of protein. Both the diffusion coefficient of HEWL(DHEWL) andT2of HEWL showed a steep decrease with the increase of agarose concentration. These results suggested that both the local molecular motion and translational molecular motion were impeded by the three-dimensional polymeric network of agarose gel, with the result of a higher local concentration of HEWL in agarose gel. The low diffusion of HEWL molecules in agarose gel probably retained the higher local concentration for a longer time, which enhanced the nucleation. In addition, in the supersaturated solution,HEWL clusters diffused more slowly than monomers due to the large hydrodynamic interaction with the agarose matrix and their small hydrodynamic radius, which promoted the crystallization of the HEWL protein.

agarose gel; NMR; HEWL; protein crystallization

2016-03-31;

2016-05-09.

上海交通大学科技创新专项-青年教师科研起步基金(AF4040006)

邹亚娟(1983-)，女，工程师，硕士，研究方向：分析化学

代博娜(1981-)，女，工程师，博士，研究方向：核磁共振在化学、生物学中的应用，Tel：021-34206175/34206173-116，E-mail：daibona@sjtu.edu.cn.

O657.32

A

1006-3757(2016)02-0069-05

10.16495/j.1006-3757.2016.02.002