SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达*

罗天霞，樊红琨，芮丹丹，孙佳翕，马小芳，章　茜#

1)郑州大学基础医学院生理学教研室 郑州 450001　2)新乡医学院基础医学院 新乡 453000



SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达*

罗天霞1)，樊红琨1)，芮丹丹1)，孙佳翕2)，马小芳1)，章茜1)#

1)郑州大学基础医学院生理学教研室 郑州 4500012)新乡医学院基础医学院 新乡 453000

SK2通道；JPH2蛋白；真核表达载体；HEK293

目的：构建SK2和JPH2双基因重组真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2，并检测其在转染后HEK293细胞中的表达。方法：以pCMV6-entry/SK2为模板,PCR扩增出SK2片段，通过BgⅢ/Hind Ⅲ酶切位点克隆入真核表达载体pIRES-EGFP，将JPH2序列插入构建的SK2表达载体pIRES-EGFP-SK2，并通过酶切及测序鉴定。脂质体转染法将重组质粒pIRES-EGFP/SK2+JPH2转染HEK293细胞，采用Western blot法检测SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达。结果：构建的重组真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2经酶切和测序鉴定，证实插入的序列与GenBank中的SK2和JPH2基因序列完全相同。pIRES-EGFP/SK2+JPH2质粒转染HEK293细胞48 h后，SK2和JPH2蛋白均能成功表达。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2。

小电导-钙激活钾通道(small conductance calcium activated potassium channel,SK channel)几乎可表达于所有可兴奋细胞[1]。SK2通道是心肌细胞的一种依赖钙离子激活的钾通道，在心肌细胞动作电位形成中起着重要作用[2-3]。Junctophilins(JPHs)存在于哺乳类和非哺乳类动物几乎所有可兴奋细胞，是与细胞间偶联膜复合体(junctional membrane complex,JMC)形成有关的一类蛋白，通过锚定细胞膜与肌质网膜而维持钙离子的稳态[4-5]。作者所在的实验室之前的研究[6]显示腺病毒介导的靶向小鼠JPH2 基因的siRNA可沉默小鼠心肌细胞JPH2 表达，同时也抑制细胞膜SK2 通道的功能。为进一步在体外研究JPH2蛋白与SK2通道的相互作用，该研究构建了SK2和JPH2双基因真核表达载体，转染哺乳动物细胞HEK293，使其能有效表达SK2通道蛋白和JPH2蛋白。

1　材料与方法

1.1材料含全长SK2 cDNA的重组克隆载体pCMV6-entry/SK2由北京傲锐东源生物科技有限公司构建。质粒pIRES-EGFP、pJPH2-pcDNA3-EGFP为实验室库存，HEK293细胞、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自XYGEN公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，胎牛血清和DMEM高糖培养基购自Hyclone公司，2.5 g/L胰蛋白酶购自Gibco公司，SK2兔多克隆抗体和JPH2兔多克隆抗体购自Sigma公司，5×SDS、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂购自北京康为世纪公司。

1.2SK2基因全长片段的获得以pCMV6-entry/SK2为模板，通过PCR扩增出SK2片段，20 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒胶回收。

1.3真核表达载体pIRES-EGFP/SK2的构建及鉴定用BgⅢ和Hind Ⅲ双酶切质粒pIRES-EGFP，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒片段。将SK2片段通过T4 DNA连接酶连入pIRES-EGFP。转化大肠杆菌DH5α，接种于含卡那霉素的LB平板培养基，37 ℃孵育过夜。挑选多个单克隆菌落接种于LB液体培养基，37 ℃，250 r/min振荡过夜。次日，提取质粒用内切酶BgⅢ和Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳，测序。

1.4真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2的构建将pJPH2-pcDNA3-EGFP质粒采用Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切，获得JPH2，插入pIRES-EGFP/SK2表达载体。所得质粒经BamHⅠ单酶切，行琼脂糖凝胶电泳并测序鉴定。

1.5重组质粒转染HEK293细胞HEK293细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM-高糖培养基中培养，37 ℃，体积分数5%CO2温箱中孵育。待细胞融合至80%～90%时按照Lipofectamine2000操作说明书进行空质粒pIRES-EGFP以及pIRES-EGFP/SK2+JPH2转染。转染6 h后换为含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。转染48 h后收集细胞。荧光显微镜下观察。

2　结果

2.1真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2的鉴定构建的真核表达载体pIRES-EGFP/SK2经BgⅢ、Hind Ⅲ双酶切后获得的目的片段为1 700 bp，与小鼠SK2基因大小一致(图1)；将测序结果与GenBank收录序列(NM_080465.2)进行Blast比对，碱基序列一致。构建的真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2经BamHⅠ酶切后得到的目的片段为2 020 bp左右，与小鼠JPH2基因大小一致(图1)；将测序结果与GenBank收录序列(NC_000068.7)进行Blast比对，碱基序列完全一致。

M:Marker;1:pIRES-EGFP/SK2的双酶切产物;2:pIRES-EGFP/SK2+JPH2的酶切产物。图1　pIRES-EGFP/SK2和pIRES-EGFP/SK2+JPH2的酶切鉴定

2.2真核表达载体转染HEK293细胞的结果将空质粒pIRES-EGFP及重组子pIRES-EGFP/SK2+JPH2转染HEK293细胞48 h，荧光显微镜下可见绿色荧光，细胞均生长良好，铺满培养皿底部，如图2所示。

2.33组HEK293细胞SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达转染pIRES-EGFP/SK2+JPH2组在60 000和74 000处可见明显印迹条带(图3)，而转染pIRES-EGFP空质粒的对照组在相应位置未见明显条带。

A:pIRES-EGFP;B:pIRES-EGFP/SK2+JPH2；1：明视野；2：荧光视野。图2　真核表达载体转染HEK293细胞48 h(×10)

1:心肌组织裂解液;2:转染pIRES-EGFP/SK2+JPH2质粒的HEK293细胞;3:转染pIRES-EGFP质粒的HEK293细胞。图3　真核表达载体转染HEK293细胞后SK2和JPH2的表达

3　讨论

重组载体构建成功的标志是外源基因成功插入到载体。该研究选用的pIRES-EGFP真核表达载体有绿色荧光蛋白报告基因，能筛选转基因的细胞，且该载体能使外源基因与EGFP同时表达，非常适合用于细胞内基因表达和蛋白质定位的研究[7]。作者首先构建pIRES-EGFP/SK2表达载体，然后将JPH2片段插入其中，最后对构建的重组质粒进行测序和酶切鉴定，测序结果显示SK2和JPH2基因与GenBank中的序列一致，酶切结果也证实重组体内整合有目的基因，说明真核表达载体pIRES-EGFP/SK2+JPH2构建成功。该载体是一个双基因表达载体，具有两个MCS多克隆位点，可插入两个基因；两个基因之间通过IRES连接，可实现两个基因翻译连锁但又独立，避免两个基因之间表达的融合，使两个蛋白功能免受相互干扰。

为检验重组载体能否转染真核细胞并使SK2和JPH2有效表达，作者选用HEK293细胞作为宿主细胞进行转染，这是因为HEK293细胞是最常用的细胞株之一，具有易于培养、外源基因整合到染色体效率高、表达外源蛋白水平高、活性好等优点，利于进行实验和结果检测[8]。通过荧光显微镜观察转染重组质粒后的细胞，可见绿色荧光蛋白的表达，说明质粒转染成功。Western blot结果证实转染pIRES-EGFP/SK2+JPH2质粒的细胞中有SK2通道蛋白和JPH2蛋白的表达，与已有报道[3,6]的结果一致。

在心脏疾病中，例如，肥厚型心肌病和心力衰竭，JPH2表达水平的降低能导致心肌细胞兴奋收缩偶联的缺陷[9]。然而，目前对JPH与胞浆膜离子通道偶联的种类及分子机制所知甚少。尤其在心肌细胞上，JPH2是否与心肌SK2通道之间有偶联作用，目前尚未见报道。

该研究成功构建了pIRES-EGFP/SK2+JPH2真核表达载体，并实现了在HEK293细胞中的有效表达，为体外进一步研究SK2通道蛋白与JPH2蛋白的相互作用打下了实验基础。

[1]STOCKER M.Ca2+-activated K+channels: molecular determinants and function of the SK family[J].Nat Rev Neurosci,2004,5(10):758

[2]ZHANG Q,TIMOFEYEV V,LU L,et al.Functional roles of a Ca2+-activated K+channel in atrioventricular nodes[J].Circ Res,2008,102(4):465

[3]MU YH,ZHAO WC,DUAN P,et al.RyR2 modulates a Ca2+-activated K+current in mouse cardiac myocytes[J].PLoS One,2014,9(4):e94905

[4]LANDSTROM AP,BEAVERS DL,WEHRENS XH.The junctophilin family of proteins: from bench to bedside[J].Trends Mol Med,2014,20(6):353

[5]TAKESHIMA H,HOSHIJIMA M,SONG LS.Ca2+microdomains organized by junctophilins[J]. Cell Calcium,2015, 58(4):349

[6]郭文静,樊红琨,郑春光,等.沉默 JP2基因对小鼠心肌细胞 SK2通道的影响[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(1):55

[7]DAI LC,XU DY,YAO X,et al.Construction of a fusion

protein expression vector MK-EGFP and its subcellular localization in different carcinoma cell lines[J].World J Gastroenterol,2006,12(47):7649

[8]PHAM PL,PERRET S,CASS B,et al.Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis[J].Biotechnol Bioeng,2005,90(3):332

[9]ZHANG HB,LI RC,XU M,et al.Ultrastructural uncoupling between T-tubules and sarcoplasmic reticulum in human heart failure[J].Cardiovasc Res,2013,98(2):269

(2015-11-19收稿责任编辑徐春燕)

Construction of an eukaryotic expression vector carried SK2 and JPH2 genes and expressions of SK2 and JPH2 proteins in HEK293 cells

LUOTianxia1),FANHongkun1),RUIDandan1),SUNJiaxi2),MAXiaofang1),ZHANGQian1)

1)DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)SchoolofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalCollege,Xinxiang453000

SK2 channel;JPH2 protein; eukaryotic expression vector; HEK293 cell line

Aim: To construct an eukaryotic expression vector carried SK2 and JPH2 genes and detect the expression of them in the transfected HEK293 cells.Methods: The full-length SK2 gene was obtained from a recombinant vector pCMV6-entry/SK2 by PCR amplification, and cloned it into the eukaryotic expression vector pIRES-EGFP. Then JPH2 gene was inserted into pIRES-EGFP-SK2 vector and was detected by endonuclease digestion and sequencing.The recombinant pIRES-EGFP/SK2+JPH2 was transfected into HEK293 cells with a liposome infection protocol. The expressions of SK2 and JPH2 protein were detected by Western blot.Results: Both endonuclease digestion and sequence analysis demonstrated that the inserted sequences of pIRES-EGFP/SK2+JPH2 were identical to those of the full-length of SK2 and JPH2 genes in GenBank. Moreover, both SK2 and JPH2 protein in HEK 293 cells transfected with pIRES-EGFP/SK2+JPH2 for 48 h were expressed successfully.Conclusion: The eukaryotic expression vector pIRES-EGFP/SK2+JPH2 as well as the expressions of SK2 and JPH2 cell lines have been successfully constructed.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.006

*国家自然科学基金资助项目81270248；81570311

，女，1957年10月生，博士，教授，研究方向:心脏生理学，E-mail:qianzhang@zzu.edu.cn

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