高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯苷及大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量

戴　晖　蒙凤贞（广东省佛山市第一人民医院（中山大学附属佛山医院）药学部　佛山　528000）

高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯苷及大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量

戴晖蒙凤贞（广东省佛山市第一人民医院（中山大学附属佛山医院）药学部佛山528000）

目的：探讨高效液相色谱法（HPLC法）对何首乌中有效成分二苯乙烯苷及大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量进行测定。方法：采用Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相选择乙腈∶水=25∶75，流速为1.0mL/min，检测波长为322nm，柱温为25℃。结果：二苯乙烯苷的线性回归方程为：Y=3.247×105X+1.951×104（r=0.9999），在4.021～40.12μg/mL范围内线性关系良好；大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷线性回归方程为：Y=1.501×105X+0.352×104（r=0.9998），在0.012～25.00μg/mL范围内线性关系良好。二苯乙烯苷的平均加样回收率为99.79%，RSD=1.23%，大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷平均加样回收率为99.51%，RSD=1.52%。结论：高效液相色谱法测定何首乌中的两种有效成分，操作简单快速，稳定性好，精密度高，重现性好，为何首乌中有效成分的含量测定提供了有效的方法。

高效液相色谱法 何首乌 二苯乙烯苷 大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷

何首乌始载于《开宝本草》，是寥科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thumb）的干燥块根［1］，有我国传统“四大仙草”之一的美称。何首乌具有解毒、截疟、消痈、润肠通便的功效，临床上用于治疗疮痈、久疟体虚、肠燥便秘等［2］。对于何首乌的成分研究多集中在其有效成分二苯乙烯苷类、蒽醌类、黄酮类以及磷脂类等的研究中［3］，目前对于核苷类成分的分析方法主要有荧光法、离子交换色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用技术等［4］。本次研究采用了高效液相色谱法对何首乌中二苯乙烯苷和蒽醌类成分大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷进行含量测定，为何首乌药材质量的综合评价提供可靠的检测手段。

1　实验材料

1.1实验仪器：美国Waters公司生产的Waters717高效液相色谱仪，配有溶剂洗脱装置、自动进样器，Waters717色谱检测系统；GR-201型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；B3201D-T型超声波清洗器；7230型电热鼓风干燥箱；SGDY5-III型电热恒温水浴箱，W2011T-I型高速冷冻离心机。

1.2实验试药：何首乌药材为我市中药材中心销售，经专家鉴定为真品；二苯乙烯苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110845-201206）；大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷（中国药品生物制品检定所，生产批号：20120425）；乙腈为色谱纯（北京化工科技有限公司，生产批号：20130223），水为三蒸水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件的选择：采用Phenomenex C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相选择乙腈∶水=25∶75，流速为1.0mL/min，检测波长为322nm，柱温为25℃，进样量为20μL，见图1。

2.2对照品溶液的制备：分别取二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品，精密称定后置于同一25mL容量瓶中，用75%乙醇溶液定溶至刻度后摇匀，精密吸取3.5mL采用75%乙醇溶液定溶至10mL容量瓶中，摇匀后即得二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备：精密称取中药材何首乌1.0g粉碎后，加入75%乙醇溶液100mL溶解后放置于回流瓶内，水浴锅中加热煮沸后回流提取45min后，冷却并称定质量，用75%乙醇溶液将损失的质量补足后摇匀，过0.22μm的微孔滤膜，得到供试品溶液。

2.4线性关系考察：精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液0、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0mL置于10mL容量瓶中，采用75%乙醇溶液定溶至刻度后，分别精密吸取20μL，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，以对照品的峰面积值作为纵坐标，对应的浓度值作为横坐标绘制线性回归方程。二苯乙烯苷的线性回归方程为：Y=3.247×105X+1.951×104（r=0.9999），在4.021～40.12μg/mL范围内线性关系良好；大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷线性回归方程为：Y=1.501×105X+0.352×104（r=0.9998），在0.012～25.00μg/mL范围内线性关系良好。

2.5精密度考察：精密吸取同一混合对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件分别重复进样5次，计算成分的色谱峰面积的RSD值分别为1.22%、1.04%，均符合精密度实验的要求，表明实验仪器的精密度良好。

2.6重复性考察：取“2.3”项下的供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件重复测定5次，计算二苯乙烯苷和大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量的RSD值分别为2.3%、1.8%，表明该方法的重复性良好。

2.7稳定性考察：取同一批次的样品药材按照“2.3”项下供试品溶液的制备方式配置溶液，分别在第1、2、4、6、10、12、16、24h按照“2.1”项下的色谱条件进样，其二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷含量的RSD值分别为1.3%、1.0%，表明供试品溶液在24h内具有较好的稳定性。

2.8加样回收率试验：取已知含量的何首乌样品共5份，精密称定后按照“2.3”项下的供试品溶液配制方法制备溶液，分别精密加入已知含量的二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，根据“2.1”项下的色谱条件及线性回归方程样品测定方法计算，结果见表1、表2。

表1　二苯乙烯苷加样回收率试验结果（n=5）

3　小结

3.1供试品溶液制备条件的选择：本次实验中比较了超声提取和回流提取的效果［5］，结果表明回流提取时提取率高于超声提取方式，提取时间短，适用于对热敏感的有效成分的提取，因此在实验中采用了回流提取的方式进行供试品溶液的制备。

表2　大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷加样回收率试验结果（n=5）

3.2检测波长的选择：通过对二苯乙烯苷紫外吸收波长的检测，结果表明在322nm处两种成分具有相对最大吸收波长，且无其他成分的干扰峰出现，因此选择322nm作为成分的检测波长。

3.3流动相和色谱柱温的选择：流动相采用了乙腈：水、甲醇：水，结果表明乙腈：水=25∶75时分离效果好。柱温考察了温度为20℃、25℃、30℃条件下两种成分的分离效果，表明在25℃时两种成分分离效果好，因此实验时选择了温度为25℃的色谱条件。

［1］李文仕.反相高效液相色谱法测定何首乌颗粒中二苯乙烯苷的含量［J］.右江民族医学院学报，2014，3（1）：362-364.

［2］彭贵龙，周光明，杨远高，等.高效液相色谱同时测定何首乌中大磺酸、大黄素和大黄酚的含量［J］.四川大学学报，2014，51（2）：350-352.

［3］高攀峰，冯鹏飞.高效液相色谱法测定调血降脂丸中何首乌苷含量［J］.实用中医内科杂志，2014，28（12）：119-121.

［4］林武俊，陈小玉，刘可福，等.HPLC法测定康欣胶囊中二苯乙烯苷的含量［J］.海峡药学，2011，23（8）：80-82.

［5］罗益远.超高效液相色谱-四级杆/线性例子质谱法同时测定不同产地何首乌中10种核苷类成分［J］.分析测试学报，2015，35 （5）：519-524.

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1672-8351（2016）09-0011-02