葡聚糖凝胶Sephadex LH -20 在天然产物分离纯化中的应用*

陈亚军，高　岩，杨春娟，苏晓琳，王　蒙，王知斌（黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

葡聚糖凝胶Sephadex LH -20 在天然产物分离纯化中的应用*

陈亚军，高岩，杨春娟，苏晓琳，王蒙，王知斌*
（黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

凝胶过滤色谱法是分离纯化天然产物的有效方法之一，Sephadex LH-20是最常用的一种葡聚糖凝胶填料，具有操作简便、分离纯度高，适用于多种有机溶剂等优点，可用于分离纯化苯丙素、黄酮、醌类、生物碱和萜类等天然产物。本文对SephadexLH-20的分离原理和特性及在天然产物分离纯化中的应用方面进行系统综述，为相关的分离纯化研究和实际生产提供了重要的参考依据。

SephadexLH-20；苯丙素；醌类；黄酮；生物碱；萜类

天然产物是药物的重要组成部分，在预防和治疗人类疾病等方面做出了巨大贡献。而天然产物之所以能够防病治病与其中所含的有效成分密切相关，因此，进一步分离和纯化天然药物中的有效成分是保证药物临床效果的关键。近年来天然产物常用的吸附剂主要是硅胶、氧化铝、聚酰胺等，但其分离效果欠佳，远达不到人们所期望的纯度。在二十世纪60年代开始使用一批新型吸附剂，羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）是一种淋洗速度快、可循环使用、无损失的分离和纯化填充材料，对多种天然产物有很好的分离和纯化效果[1]，所以使用SephadexLH-20作吸附剂，水、甲醇等做流动相，对天然产物进行分离纯化，是一种值得深入探究的实验方法。

1　Sephadex LH-20的特性及分离原理

1.1Sephadex LH-20的特性

交联葡聚糖凝胶（Sephadex gel）是具有多孔性三度空间网状结构的高分子化合物，属于软性凝胶，其微孔能吸入大量的溶剂，溶胀至干体积的多倍，Sephadex LH-20为葡聚糖凝胶经羟丙基化处理后得到的产物，它既有亲水性，又有亲脂性，不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用，如丁醇、氯仿、四氢呋喃等。SephadexLH-20除了保留葡聚糖凝胶原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中也能起到分配色谱的效果，适用于不同类型天然产物的分离。

1.2Sephadex LH-20的分离原理

Sephadex LH-20的分离原理主要有两方面：（1）利用分子排阻色谱原理，根据凝胶的孔径和被分离化合物分子的大小达到分离目的。凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质，被分离物质的分子大小不同，它们能够进入凝胶内部的能力也就不同，当混合物溶液通过凝胶柱时，小分子可自由进入凝胶内部，大分子不能进入凝胶内部，只能通过凝胶颗粒间隙。因此，分子大小不同的物质在凝胶过滤色谱中的移动速率出现差异，而达到分离。（2）Sephadex LH-20对化合物还起分配色谱的作用，若Sephadex LH-20在有机溶剂中膨润，则极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

1.3Sephadex LH-20洗脱溶剂的选择及样品处理

要根据被分离物质的极性选择 Sephadex LH-20的洗脱溶剂：以甲醇-水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100%甲醇冲柱。对于样品的处理，如果样品极性大，则选用反相溶剂洗脱，将样品用尽可能少的甲醇-水溶解，过滤后，湿法上样。如果样品极性小，则选用正相溶剂洗脱，样品用最少体积的氯仿-甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

2　Sephadex LH-20的使用

2.1使用前溶胀

Sephadex LH-20在使用之前必须要进行溶胀，而且在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形颗粒。方法：在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少3h，溶胀后凝胶体积的大小取决于所使用的溶剂系统，使溶胀体积沉降后占总体积的75%，上层溶剂占25%[2]。

2.2再生与保存

Sephadex LH-20价格比较昂贵，使用过的Sephadex LH-20可以反复再生使用。再生处理方法：使用稀酸、稀碱及水反复再生处理，即可恢复树脂的吸附能力。保存方法：短期不用时可以水洗→含水醇洗（醇的浓度逐步递增）→醇洗，最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。若长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60～80℃干燥后，保存即可。

表1　Sephadex LH-20在常用溶剂中的膨胀体积和溶剂吸收率Tab.1　Expanding volume and solvent absorption of Sephadex LH-20 in common solvents

3　Sephadex LH-20对天然产物的分离纯化

3.1分离纯化苯丙素类化合物

苯丙素是一类具有C6-C3芳香核骨架的天然产物，是多种天然药物的有效成分之一，包括苯丙烯、苯丙醇、香豆素等天然芳香族化合物。佛手在我国已有400多年的种植和应用历史，是我国传统的名贵中药材。采用SephadexLH-20等方法对佛手所含化合物进行分离纯化，采用氯仿-甲醇（1∶1）洗脱，结果从川佛手中分离得到6个香豆素类化合物，分别为：柠檬内酯、6,7-二甲氧基香豆素、5-异戊烯氧基-7-甲氧基香豆、5-羟基-7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素、6-羟基-7-甲氧基香豆素、佛手柑内酯[3,4]。绿原酸是由咖啡酸和奎宁酸组成的缩酚酸，属于苯丙素类化合物，用Sephadex LH-20层析柱对其进行纯化，洗脱条件为：先用上样体积8倍的pH值为3.0的HCl快速冲洗，再改用10倍上样体积的蒸馏水洗脱，其次用15倍上样体积的0.5%乙酸乙酯水溶液洗脱，最后直接用50%乙醇洗脱到柱子干净为止。收集乙酸乙酯分离馏分，可得纯度达98.3%绿原酸，得率大于35%[5]。

3.2分离醌类化合物

醌类化合物是一类含有醌式结构的天然产物，主要分布在廖科、茜草科、豆科等植物中。茜草有凉血、祛瘀、止血、通经之效，对其化学成分进行分离研究，采用SephedexLH-20凝胶柱色谱等方法从茜草根茎乙醇提取物中分离鉴定了12个蒽醌类化合物，经鉴定，分别为：1-羟基-2-甲基蒽醌、1,4-二羟基-2-甲基蒽醌、2,3-二甲基-1,4-二羟基蒽醌、1,3-二羟基 -2-乙氧基甲基 9,10-蒽醌、ω-hydroxypachybasin，cordifoliol[6]。白花丹参对血栓闭塞性脉管炎具有独特疗效，对白花丹参的化学成分进行分离研究，采用SephedexLH-20柱层析等方法从该植物中分离得9个丹参酮类化合物：二氢丹参酮I、次甲丹参醌、1,2一二氢丹参醌、次甲二氢丹参醌、1,2,15,16-四氢丹参醌、丹参新醌乙、Arucadiol、丹参酮IIB、羟基次甲丹参醌[7]。

3.3分离纯化黄酮类化合物

黄酮类化合物主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物，这类化合物大多呈黄色或淡黄色。大豆中的大豆异黄酮主要成分是染料木苷和黄豆苷，二者的结构相似，利用Sephadex LH-20柱可以有效分离纯化染料木苷和黄豆苷。分离过程中选用40%的甲醇水溶液做洗脱剂，上样前，凝胶柱用两倍柱容积的10%甲醇平衡。流速恒定为1mL·min-1。其中最佳分离条件为40%的甲醇水溶液做洗脱剂，上样量为100mL。分离得染料木苷和黄豆苷，经分析得到了单一峰，二者最终纯度均大于90%[8]。黄酮为凤尾草所含的主要化学成分之一，应用Sephadex LH-20柱色谱对凤尾草化学成分进行分离、纯化，结果从凤尾草乙酸乙酯分离了9个黄酮类化合物，分别为芹菜素，芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷，野漆树苷，芹菜素7-O-β-D-葡萄糖-4'-O-α-L-鼠李糖苷，新西兰牡荆苷，木犀草素，木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷，忍冬苷，木犀草素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷[9]。

3.4分离生物碱类化合物

生物碱是一类含氮的有机化合物，分布于植物界的50多个科的120多个属中，如毛茛科黄连、胡椒科蒌叶、石蒜科红花石蒜等。蒌叶具有破痰积、治心腹虫痛等作用，利用SephadexLH-20柱色谱法等分离手段，从蒌叶茎70%丙酮提取物的乙酸乙酯层中分离得到8个生物碱类化合物，鉴定为胡椒碱，墙草碱，N-isobutyl-2E,4E-dodecadienamide，piperdardine，dehydropipernonaline，piperolein-B，guineensine[10]。利用SephadexLH-20柱层析等方法对红花石蒜中的生物碱成分进行分离纯化，从中分离得6个单体化合物，分别是：小星蒜碱，二氢石蒜碱，lycoramine，6-O-ethyllycorenine，homolycorine，O-demet hylhomolycorine[11]。

3.5分离纯化萜类化合物

萜类化合物就是指存在自然界中、分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧衍生物，存在于多种中草药中，如柴胡、三七、枫杨等。枫杨具有抗肿瘤、抗病毒、治疗牛皮癣等药理作用，目前关于枫杨化学成分的报道却很少，采用SephadexLH-20及重结晶等方法对枫杨树皮、90%乙醇提取物的氯仿和乙酸乙酯萃取层进行分离纯化。结果分离得到7个三萜类化合物，鉴定为：算盘子酮、羽扇豆-1β, 3β-二醇、乌苏酸、白桦脂酸、30-norlupan-28-oic acid、杨齐墩果酸、2α,3β,19α-trihydroxurs-12-en-28-O-β-D-glucopyranoside[13]。橄榄苦苷属于无毒的苯酚类裂环环烯醚萜苷类化合物，利用Sephadex LH-20分离纯化橄榄苦苷，具体方法为：称取SephadexLH-20（50～100目）20g，加入蒸馏水100mL，浸泡过夜，进行溶胀。SephadexLH-20层析柱的直径与柱长之比为1∶1，纯化流速1mL·min-1。橄榄苦苷经过二次过柱，其纯度可达82.9%[14]。

4　结论

Sephadex LH-20可用于多种天然成分的提取分离，并且具有操作简便快捷，分离纯度高，得率大、可重复利用等优点。在这里对使用Sephadex LH-20时仍需注意的问题进行了总结：（1）流速不可太快，柱子尽可能长，Sephadex LH-20柱长的增加将极大地改善分离。（2）馏分一定要接的细，可1/10，或1/20个保留体积接一馏分。洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（3）对于具有荧光性质的化合物，可在层析柱两端加紫外灯照射，便于检测该类化合物的流向。（4）填料反复使用，每次用完，可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。

本文对SephadexLH-20的特性、分离原理、使用方法及应用实例进行综述，并完善了凝胶滤过法在药物生产中的应用，为SephadexLH-20在药物的分离纯化方面的应用提供有利的参考。

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Application of dextran gel Sephadex LH-20 in separation and purification of natural products*

CHEN Ya-jun，GAO Yan，YANG Chun-juan，SU Xiao-lin，WANG Meng，WANG Zhi-bing
（Key Laboratory of Basic and Applied Research in North Medicine，Ministry of Education，Heilongjiang Key Laboratory of Drug Efficacy Study Material of Traditional Chinese Medicine and Natural Product，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Gel filtration chromatography is one of the effective methods to isolate and purify natural products，Sephadex LH-20 is one of the most commonly used dextran gel，It has the advantages of simple operation，high separation purity，and is suitable for many kinds of organic solvents，can be used for separation and purification of the natural products of the natural products such as，phenylpropanoids，quinones，flavonoids，alkaloids and triterpenoid Saponins.In this paper，the separation principle and characteristics of Sephadex LH-20 and its application in the separation and purification of natural products are summarized，It provides an important reference for the study of the separation and purification and the actual production.

sephadex LH-20；phenylpropanoids；quinones；flavonoids；alkaloids；terpenes?

R284.2

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160853

2016-03-25

黑龙江省省留学归国人员科学基金（LC2012C15；LC20150 31）,黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”科研项目（2012RCD05）；国家自然科学基金面上项目（81573551）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（2013232 7120002）

陈亚军（1992-），女，在读硕士研究生，研究方向：中药药效物质基础。

王知斌（1976-），男，副教授，主要从事中药药效物质基础和新药临床前药学研究。