维生素C对体外培养的H9C2心肌细胞系的影响

任晨霞　麻丽霞　郭　萍　郭　颖　曹文君



维生素C对体外培养的H9C2心肌细胞系的影响

任晨霞麻丽霞郭萍郭颖曹文君

目的：探讨维生素C对大鼠H9C2心肌细胞抗氧化能力与细胞活力的影响。方法：以体外培养的大鼠H9C2心肌细胞为研究对象，在培养过程中，分别加入不同浓度的维生素C，观察细胞形态，MTT法检测心肌细胞活力，DCFH-DA荧光探针法测定维生素C对H2O2处理的心肌细胞活性氧(ROS)生成的影响，用比色法检测半胱天冬酶(caspase)-3和caspase-9活性。 结果：0.05 mg/mL维生素C处理后，H9C2心肌细胞形态发生变化，细胞质中颗粒状物质增多，排列紊乱，间隙增宽； 0.05 mg/mL维生素C可有效抑制H2O2导致的ROS积累；但随着培养基中维生素C浓度的升高，心肌细胞存活率明显降低，且维生素C处理后caspase-3和caspase-9活性明显升高。结论：H9C2心肌细胞培养中添加维生素C可产生明显的抗氧化作用，但维生素C对H9C2心肌细胞生长具有抑制作用。

维生素C；H9C2心肌细胞；细胞活力

心肌病是由于心室结构改变和心肌受损引起心脏功能障碍的病变。研究发现，在心肌损伤区出现大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累[1]。心肌缺血再灌注过程中，大量氧自由基的产生可引起心律失常以及心肌梗死面积扩大等现象[2]。早期酒精性心肌病大鼠模型的心肌组织中，过氧化物产物丙二醛水平显著升高，而清除氧化物和自由基的过氧化物酶体和金属硫蛋白水平降低[3]。心肌细胞氧化应激是导致心肌功能紊乱的一个重要因素。减少ROS产生、消除心肌细胞的氧化应激可减轻心肌损伤[4-7]。因此，抗氧化药物是心血管疾病治疗中的重要部分。

维生素C(即抗坏血酸)具有多种生物学功能，是细胞中氧自由基的清除剂，参与体内氧化还原反应及羟化反应。风湿性心脏病患者血清中维生素C水平显著高于健康人，其分子机制仍不明确[8]。本文主要探讨维生素C对体外培养的H9C2心肌细胞系的影响。

1　材料与方法

1.1材料

大鼠H9C2心肌细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院。DCFH-DA荧光探针法ROS检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所，半胱天冬酶(caspase)-3、caspase-9活性检测试剂盒购于南京建成生物技术研究所；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购于赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养向细胞培养瓶中添加含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，置于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。待细胞生长至70%～80%融合状态时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，培养6～7代后进行后续实验。

1.2.2MTT实验取对数生长期的心肌细胞，胰蛋白酶消化后进行细胞计数，按1×104个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 μL细胞悬液。将96孔板放置在37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，换用无血清培养液200 μL/孔饥饿培养24 h，使细胞生长同步化至G0期。吸弃上清液，分别加入含不同浓度维生素C的培养液，培养至测定时间。每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT，避光孵育4 h后终止培养，吸弃上清，每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，将培养板置于水平摇床上37℃轻摇10 min。采用酶标仪在490 nm波长下测定各孔吸光度值。

细胞存活率=处理组吸光度/对照组吸光度×100%

1.2.3心肌细胞内ROS水平的检测将心肌细胞以2×105个/mL的密度接种于6孔板中，无血清培养液同步化饥饿培养24 h后，分为对照组、过氧化氢(H2O2)组(加入50 μmol/L H2O2)、H2O2+维生素C组(加入50 μmol/L H2O2和 0.05 mg/mL维生素C)、维生素C组(加入0.05 mg/mL维生素C)，分别培养24 h。用无血清DMEM按1∶1 000比例稀释DCFH-DA探针，使其终浓度为10 μmol/L，吸弃6孔板中的培养液，每孔加入1 mL稀释好的DCFH-DA，37℃避光孵育30 min后，用无血清DMEM培养液洗涤细胞3次。将6孔板置于荧光倒置显微镜下观察细胞内的荧光强度，采集图像。

1.2.4凋亡活性检测采用比色法测定心肌细胞中caspase-3、caspase-9的活性。0.05 mg/mL 维生素C处理H9C2细胞24 h后，经胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS洗涤1次后吸去上清，加入50 μL细胞裂解液，反复冻融3次后，12 000 转/min、4℃离心15 min，吸取上清液按照试剂盒说明书进行操作，在405 nm波长下测定吸光度值。

1.3统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，每项实验均独立重复3次。采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。两组间差异比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1心肌细胞形态

正常心肌细胞呈梭形，细胞界限清晰，排列规整；0.05 mg/mL维生素C组H9C2心肌细胞形态不规整，细胞质中颗粒状物质增多，排列紊乱，间隙增宽(见图1)。

注： A为对照组；B为维生素C组

2.2心肌细胞存活率

维生素C处理后24 h后心肌细胞活力显著下降，0.05 mg/mL维生素C干预导致细胞存活率降至66.06%，随着浓度增高细胞存活率降低至50%以下(见图2)。在0.05 mg/mL维生素C作用下，心肌细胞存活率不随培养时间的延长而变化(见表1)。

注：与未加维生素C组相比，(1)P<0.01

2.3维生素C的抗氧化作用

与对照组相比，H2O2组心肌细胞内ROS荧光明显增强，而H2O2+维生素C组ROS荧光强度明显低于H2O2组(见图3)。

2.4caspase-3和caspase-9活性

与对照组相比，维生素C组H9C2心肌细胞内的caspase-3和caspase-9的活性均显著上升(P<0.01，见图4)。

表1　不同时间点 0.05 mg/mL维生素C处理对H9C2心肌细胞活力的影响

注：与对照组相比，(1)P<0.01

注： A为对照组；B为H2O2组；C为H2O2 +维生素C组；D为维生素C组

注：与对照组相比，(1)P<0.01

3　讨论

心肌细胞的氧化应激状态与心肌损伤密切相关[9]，ROS可作为信号分子激活致心肌细胞肥大或细胞凋亡的信号通路[10]。高水平ROS会破坏生物大分子、线粒体和细胞膜的结构，导致心律失常或心肌功能障碍[11]。减少病理情况下细胞内氧自由基的产生，防止细胞膜损伤和脂质过氧化，对减轻或防止心功能障碍具有重要意义。

正常生理状态下，心肌细胞通过抗氧化酶或维生素等抗氧化剂来维持ROS的低水平状态。维生素C是一种广泛应用的抗氧化剂，已有研究表明维生素C可有效减轻肾和骨骼肌的氧化损伤，但是其对心肌的保护作用及机制的研究较少[12-13]。本研究发现，H2O2可引起心肌细胞内产生大量ROS，而维生素C可有效抑制ROS的积累，说明维生素C在抗氧化方面具有明显效果，能够改善氧化应激状态，对心血管疾病的预防和治疗有一定的积极作用。

然而，正如机体内环境中的葡萄糖、脂类物质积累过多会导致细胞毒性一样，维生素C过多积累也会产生细胞毒性。本研究发现，维生素C可降低H2O2引起的心肌细胞中ROS产生，但同时可显著抑制心肌细胞的生长，并提高凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9的活性。这说明维生素C在发挥抗氧化作用之外，还存在其他信号调控通路，有待于进一步研究。

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(收稿：2016-03-03修回：2016-06-02 )

(本文编辑：梁英超)

Effect of vitamin C on cultured H9C2myocardial cells

REN Chenxia,MA Lixia,GUO Ping,GUO Ying,CAO Wenjun.

Institute of Cardiovascular Diseases,Changzhi Medical College,Shanxi046000,China

Objective:To investigate the effect of vitamin C on the antioxidant capacity and cell viability of H9C2cell lines.Methods:The cultured H9C2cells were treated with vitamin C of different concentrations,and cell morphology was observed under inverted microscope.MTT assay was used to test the cell viability.Fluorescent probe DCFH-DA was used to determinate the effect of vitamin C on the intracellular ROS induced by H2O2.The activity of caspase-3 and caspase-9 were tested by colorimetric method.Results:The morphological changes of H9C2cardiomyocyteswere observed after treatment of 0.05 mg/mL vitamin C,including the increase of granular substance in the cytoplasm,arranged disorder and widened intercellular gap.0.05 mg/mL vitamin C could inhibit the accumulation of ROS caused by H2O2,but with the increase of vitamin C concentration,the survival rate of cardiomyocytes decreased significantly and the activity of caspase-3 and caspase-9 increased significantly.Conclusion:Vitamin C has a significant antioxidant effect on the H9C2cardiomyocytes,but it can significantly inhibit the cell growth.

Vitamin C; H9C2cardiomyocytes; Cell viability

山西省基础研究计划项目(2015021185)；长治医学院科技创新团队项目(CX201507)；长治医学院普及项目(QDZ201503)

046000长治医学院心血管病研究所

曹文君，Email：wjcao16@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.04.012