动态发酵合成球形细菌纤维素条件研究

章　翠，毕继才，陈华美，王艳梅，刘四新，李从发*

（海南大学食品学院，海南海口570228）

动态发酵合成球形细菌纤维素条件研究

章翠，毕继才，陈华美，王艳梅，刘四新，李从发*

（海南大学食品学院，海南海口570228）

细菌纤维素（BC）是优良的新型生物材料，尤其以球形BC为代表，在各领域应用广泛。目前，动态发酵产BC多以不规则团块状、星球状、丝状为主，应用范围较局限。故通过控制生产条件，获得均匀度较高的球形BC有着迫切的需要。在动态发酵时，以椰冻驹形杆菌（Komagataeibacter nataicola）Y19作为生产菌株，以中等大小BC的质量及数量百分比为考察指标，研究转速、发酵液液深及发酵容器直径引起的供氧效率及剪切力变化对动态发酵产球形BC合成规律的影响。结果表明，供氧效率提高、剪切力增大时，可使球形颗粒变小，颗粒数量增加。在发酵容器直径为6.0 cm，液深为2.40～2.75 cm，转速为130 r/m in时，中球BC质量与数量百分比均＞40%，均匀度最佳。

球形细菌纤维素；球粒细菌纤维素形貌；动态发酵

细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）具有高化学纯度、高聚合度［1］、高结晶度、吸水性好、持水力强、良好的生物相容性、超精细的网状结构和生物降解［2-4］等优于植物纤维素的特点，使其在生物医药、化妆品［5］、造纸、食品工业等领域有着广阔的应用前景［6-8］。而球形BC则具有更大的比表面积及更多的纳米级空隙，赋予其更高的细胞亲和性［9］及吸附能力，HU M等［10］在球粒型BC上培养人成骨细胞，发现其能快速地吸附和生长，具有良好生物相容性。ZHU H X等［11］还报道了用球形BC吸附牛血清白蛋白和铅离子（Pb+）的实验，发现其不仅吸附好，而且洗脱率高，洗脱率分别达到92.1%和75.2%，显示了良好的重复利用的特点。

BC主要有静态培养和动态培养两种发酵方式［12］。静态发酵时可在发酵液表面收获凝胶态膜状纤维素产物。但具有诸多缺点，如所需劳动力大，生产效率低［13］，且发酵占用空间大、发酵周期长、易感染杂菌、产品质量无法得到保证等。目前，动态发酵生产细菌纤维素主要包括摇瓶培养、搅拌式反应器、气升罐、转盘式反应器等［14］。动态法产生的细菌纤维素分散在发酵液中，产量较低，且所产BC形态各异，多以星球状、不规则团块状、无规则颗粒状或丝状为主，以及少数的球形BC。目前球形BC在各领域的应用价值较高，但由于生产的不稳定性［15］，限制了其广泛的应用。只有优化发酵条件，获得大小适中、规则均匀又数量多、产量高的球粒型BC，才能获得更大的应用前景及应用价值。CZAJA W等［9］发现通过控制合适的振荡条件，利用木醋杆菌（Acetobacter xylinum）NQ-5可获得直径Φ=5 mm的球形纤维素产物，并推测在动态培养过程中，振荡产生的剪切力，使产生的纤维丝相互交织，并折叠成球形颗粒。YANG H等［16］通过控制木醋杆菌（A.xylinum）JCM 9730（ATCC 700178）动态发酵时摇床转速、锥形瓶及装液量等条件，可获得接近球形的细菌纤维素颗粒。殷智超［17］研究发现动态发酵培养过程中，通气量过大，细菌数量增多，但纤维素产量却极低。而适当提高发酵中期的通气量，可以克服发酵过程中粘度增加对溶氧量的影响，从而获得较高的BC产量。

目前对于球形BC的均匀度的评价还较少，余敏华等［14］以0.5～0.8 cm颗粒的产率为考察指标，对颗粒的均匀度进行较为简单的判断。由于细菌纤维素湿质量称量时误差较大，故本实验产量均以干质量进行评价，首先按所合成纤维素球粒的规格大小对产物进行分类，以中球质量及数量百分作为均匀度的考察指标，并通过分析不同发酵条件下不同规格球形BC百分比的变化趋势，研究发酵条件对动态产球形BC颗粒大小的影响情况，为动态发酵合成球形BC未来实现规模化生产奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

椰冻驹形杆菌（Komagataeibacter nataicola）Y 19，海南大学食品学院食品生物技术研究室保藏。

发酵椰子水：选取市售成熟椰子，取破壳后的椰子水，用八层纱布滤去杂质后，置于10 L的洁净塑料桶中，在室温条件下进行预发酵7 d的处理，再以干净矿泉瓶分装、置于-20℃冷柜冻存备用。

1.1.2试剂

椰子水、蔗糖为市售；MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4、NaOH、酵母提取物、一水合柠檬酸：广州化学试剂厂；蛋白胨（生化试剂）：湛江市光华化学厂；无水葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司。试验所用试剂均为分析纯。

1.1.3培养基

斜面试管培养基：（NH4）2SO43 g/L，MgSO40.3 g/L，KH2PO40.3 g/L，新鲜椰子水50%（V/V），琼脂2.0%～2.5%，pH 5.0，加糖至可溶性固形物（糖度）50 g/L。

液体发酵种子培养基：（NH4）2SO43g/L，MgSO40.3g/L，KH2PO40.3 g/L，预发酵椰子水70%（V/V），pH3.8，加糖至可溶性固形物（糖度）50 g/L。

HS（Hestrin Schramm）培养基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.7 g/L，一水合柠檬酸1.15 g/L，pH 6.0。

上述培养基均于121℃灭菌20 min。

1.2仪器与设备

Y 5-840-1超净工作台：上海博讯实业有限公司；ZHWY-2112B恒温培养振荡器：上海智成分析仪器制造有限公司；G154DW立式自动压力蒸汽灭菌器；致微（厦门）仪器有限公司；PB303-N电子精密天平；上海安亭科技仪器厂。

1.3实验方法

1.3.1细菌纤维素的动态发酵

将斜面保藏菌株Y 19活化后接一环菌苔于液体发酵种子培养基（装液量40m L/100m L）中，30℃静置培养24h制成种子液。按2%接种量接入HS培养基（装液量80m L/200m L）中，30℃、130 r/min，摇床培养7 d。

1.3.2转速对动态发酵合成球形BC的影响

在HS培养基（装液量80m L/200m L）中接种后，分别在50 r/min、80 r/min、110 r/min、120 r/min、130 r/min、170 r/min、200 r/m in，30℃动态培养7 d，测定BC产量。

1.3.3培养基液体深度对动态发酵合成球形BC的影响

装液量分别为30 m L/200 m L、40 m L/200 m L、50 m L/ 200m L、60m L/200m L、70m L/200m L、80m L/200m L、90m L/ 200 m L、100 m L/200 m L、110 m L/200 m L、120 m L/200 m L、130m L/200m L、140m L/200m L液体培养基，使液深呈现梯度，其依次为1.00 cm、1.35 cm、1.70 cm、2.05 cm、2.40 cm、2.75 cm、3.10 cm、3.45 cm、3.80 cm、4.15cm、4.50 cm，30℃、130 r/m in动态培养7 d，测定BC产量。

1.3.4容器直径对动态发酵合成球形BC的影响

选用不同型号的烧杯，其杯身直径分别为4.0cm、4.9 cm、6.0 cm、6.8 cm、8.2 cm、9.0 cm、10.5 cm。液深为2.8 cm，30℃、130 r/m in动态培养7 d，测定BC产量。

1.3.5细菌纤维素产量测定

从培养基中取出纤维素，蒸馏水冲洗后，用0.1 mol/L NaOH溶液80℃浸泡30 min，再用蒸馏水冲洗，如此反复，直至纤维素膜呈乳白色半透明，然后使用0.5%乙酸浸泡以中和NaOH，再用蒸馏水冲洗至中性，将其置于无菌去离子水中，备用。以上处理均设置3个重复。将空白平板置于85℃干燥箱烘干至恒质量，记录质量为W1，而后将清洗过的BC置于平板上，烘干至恒质量，记录质量为W2，所产BC干质量为（W2-W1），本实验均采用干质量来描述细菌纤维素的产量。

1.3.6球形BC的描述和评价方法

不同大小的球形BC有不同的应用途径，根据所需大小的球形BC，可设定不同规格，现认为球形BC直径在0.5～0.8 cm范围时大小适中。本实验以获得直径为0.5～0.8 mm之间球形BC为目标，将获得的BC，于水中先后过0.8 cm和0.5 cm孔径铁制分类筛，将球形BC按照颗粒直径大小分为3个规格：小球BC直径（Φ＜0.5 cm）、中球BC直径（0.5≤Φ＜0.8 cm）和大球BC直径（Φ≥0.8 cm）。

为反映所合成球形BC颗粒的均匀程度，以3种直径的BC颗粒在全部BC产物中质量及数量占比来描述。当中球BC质量及数量百分比达40%以上，认为大小均匀一致，其占百分比越高，均匀度越高。不同大小球形BC占总BC产量及数量百分比的计算公式如下：

式中：m1为所有小球的干质量，g；m2为所有中球的干质量，g；m3为所有大球的干质量，g；m为总BC产量干质量，g。

式中：N为所产BC总颗粒数；N1为小球BC的颗粒数；N2为中球BC的颗粒数；N3为大球BC颗粒数。

2　结果与分析

动态发酵合成的BC根据发酵条件而呈多样化形态，只有大小适中、规则均匀又数量多、产量高的球粒型BC能有更大的应用价值。前期实验表明动态发酵合成球形BC的产量、外观形貌、均匀程度等与菌株、接种量、转速、装液量、发酵时间、发酵容器、以及外援添加物等关系密切，本实验着重研究了影响摇瓶培养的供氧效率及剪切力的几个因素如摇床转速、培养液深度及发酵容器直径对动态发酵条件合成球形BC的产量和质量情况，尤其是均匀度的情况。

2.1转速对动态发酵产球形BC合成情况的影响

2.1.1转速对动态发酵产球形BC形貌的影响

转速对球形BC具有显著的影响，通过改变动态发酵时的转速，可提高动态发酵培养时的供氧效率及剪切力，从而获得一系列的球形BC，结果如图1所示。通过对球形BC形貌、产量分析，大小数量比率等数据，探究供氧效率及剪切力对球形BC合成的影响。

图1　不同转速条件下产球形BC的形貌Fig.1 Morphology of sphere-like BC at different rotate speeds

由图1可知，转速80～200 r/min时，所产的BC颗粒均为实心光球，但大小数量有所变化。从表观上可以看出，转速为200 r/min时是细小的颗粒，中间由一根丝状体串联成串，有零星的球状颗粒散落在外；随着转速的增加，供氧效率的提高，球形颗粒直径呈明显的减小趋势，颗粒数逐渐增加，当转速为80 r/min时颗粒数较少，单球直径最大可达3 cm，而在50 r/min时为团块状BC。

2.1.2转速对动态发酵产球形BC均匀度的影响

（1）转速对BC总产量和不同大小球形BC质量百分比的影响

转速升高，供氧效率升高，但BC产量逐步下降，其原因可能是溶解氧过高时菌体不断分裂，能源物质主要被用于自身生长，而产纤维素的代谢途径被抑制或是还未满足某种代谢条件而未顺利进行，甚至可能是由于菌体对剪切力敏感性较强，转速的提高，剪切力变大，从而使菌体生长及生产稳定性变差且容易突变［17］。

图2　转速对BC总产量和不同大小球形BC质量百分比的影响Fig.2 Effect of rotate speed on total yield o f BC and qua lity percent of sphere-like BC w ith different sizes

由图2可知，当供氧效率增高时，小球BC质量百分比随之升高，在转速＞170 r/min之后，所产球形BC均为直径＜5 cm的小颗粒；与之相对的大球BC质量百分比在转速80 r/min时达到最高值93.5%，而后随供氧效率的增加快速减小，直至质量百分比为0。只有在转速为130 r/min时，中球BC质量百分比达到最高40.29%，形貌均匀一致。其他转速下所产中球BC质量百分比均＜40%。

（2）转速对BC总产量和不同大小球形BC数量百分比的影响

由图3可知，随着转速升高，供氧效率提高，大球BC数量百分比从最高75.00%降至0，小球BC数量百分比不断增高，从0升高至100%，中球BC数量百分比由0先升高至48.96%而又后降至0，在转速为130 r/min时，中球数量百分比达到最高为48.96%。

结果表明，转速为130 r/min时，此时供氧量最为合适，均匀度最好，所产中球BC产量与数量百分比均达到最高值分别为40.29%与48.96%，符合均匀度设定标准，认为其均匀度较佳。因此，转速为130 r/min时发酵培养为宜。

图3　转速对BC总产量和不同大小球形BC数量百分比的影响Fig.3 Effect of rotate speed on total yield of BC and quantity percent of sphere-like BC with different sizes

2.2液深对动态发酵产球形BC合成情况的影响

2.2.1液深对动态发酵产球形BC形貌的影响

培养基液体深度对动态合成球形BC情况的影响结果见图4。由图4可知，从表观形貌发现，所产的球形BC均为实心球，但大小、数量及外观变化较大。液深为1.00 cm时，供氧效率较高，为细小的颗粒，球形颗粒外还零星分布着小刺毛；随着溶液深度的增加，供氧效率降低，球形颗粒变大，刺毛逐步减少，当液深达2.05 cm后，均为光滑的球形颗粒。颗粒数随液体深度的增加呈先增加后减少的趋势。

图4　动态发酵时不同液深条件下产生的球形BC的形态Fig.4 Morphology of sphere-like BC in d ifferent liquid depth during dynam ic fermentation

2.2.2液深对动态发酵产球形BC均匀度的影响

（1）液深对BC总产量和不同大小球形BC质量百分比的影响

由图5可知，随着液深升高，BC产量在液深1.35 cm后，产量呈减小的趋势，其原因是在同一发酵容器中，球形BC产量、形貌、大小及数量与液体深度有关，液体中的含氧量会随着液深的增加而降低［18］，从而抑制了菌体的生长繁殖，产量降低。而在液深为1.00 cm时，供氧效率最高，但BC产量1.35 cm时较低，其可能是由于培养基量较少，营养不足，从而导致产量较低。当供氧效率下降时，小球BC质量百分比随之下降，当液深达到3.45 cm以后，小球BC质量百分比均＜5%；与之相对的大球BC质量百分比随着液深的增加占比不断升高，大球BC质量百分比保持在80%以上。在液深为2.40 cm、2.75 cm时，中球BC质量百分比分别为40.96%、43.05%，质量百分比均达到40%以上，可认为其所产BC形貌均匀度较好。

图5　液深对BC总产量和不同大小球形BC质量百分比的影响Fig.5 Effect of liquid depth on total yield of BC and quality percent of sphere-like BC with different sizes

（2）对BC总产量和不同大小球形BC数量百分比的影响

图6　液深对BC总产量和不同大小球形BC数量百分比的影响Fig.6 Effect of liquid depth on total yield of BC and quantity percent of sphere-like BC w ith differen t sizes

由图6可知，在液深为1.00～1.70 cm，供氧效率较高，此时所产均为小球，随着供氧效率的降低，小球BC数量百分比由100%逐渐下降至8.06%，大球BC数量百分比由0逐渐上升至64.40%，而中球BC数量百分比先由0%增加至48.96%而后减少至27.54%，在液深为2.40～4.15 cm时，中球BC数量占比均超过40%。

结果表明，在液深为2.40～4.15 cm时，中球数量百分比均超过40%，但结合中球BC质量百分比发现，在液深3.10～4.15 cm时质量百分比低于40%，故确定在液深为2.40～2.75 cm时均匀度最佳。

2.3发酵容器直径对动态发酵产球形BC合成情况的影响

2.3.1发酵容器直径对动态发酵产球形BC形貌的影响

在不同发酵容器直径下获得一系列球形BC结果见图7。

图7　动态发酵时不同发酵容器直径产生的球形BC的形态Fig.7 Morphology of sphere-like BC in different fermentation vessel diameter during dynam ic fe rm enta tion

由图7可知，从形貌上观察，所产的球形BC均为实心球，但大小、数量、外观变化较大。液深一定时，发酵容器直径越大，供氧效率越快，所产BC颗粒越小。随着球形颗粒的变小，BC球数量逐步增加。

2.3.2发酵容器直径对动态发酵产球形BC均匀度的影响（1）对BC总产量和不同大小球形BC质量百分比的影响

图8　容器直径对BC总产量和不同大小球形BC质量百分比的影响Fig.8 Effect of vesse l diam eter on BC total yield and quality percent of sphere-like BC w ith different sizes

由图8可知，随着发酵容器直径的增加，表面积增大，气液接触面积变大，氧气溶入液体培养基的速度也会越大，即其溶氧量也会越大［18］，此时小球BC质量百分比随之上升，当杯身直径达到9.0 cm后，均为小球BC，质量百分比达100%；而大球BC质量百分比随着杯身直径的增加而降低，直至质量百分比为0。在容器直径为6.0 cm和6.8 cm时，中球BC质量百分比均超过40%，分别为41.29%和43.24%，所产BC均匀度较好。但BC产量随发酵容器直径呈减少的趋势，其原因可能是发酵容器直径的增加会带来高剪切力，从而影响产量。

（2）对BC总产量和不同大小球形BC数量百分比的影响

图9　容器直径对BC总产量和不同大小球形BC数量百分比的影响Fig.9 Effect o f vessel d iam ete r on BC total yield and quantity percent of sphere-like BC w ith different sizes

由图9可知，随着容器直径的增加，溶氧量增加，大球BC数量百分比逐渐降低，小球BC数量百分比不断增加，中球BC数量百分比先增大后减小，在容器直径为4.9～6.8 cm之间时，中球数量百分比均超过40%，在直径为6.0 cm时，中球BC数量百分比达到最大值53.51%。

结果表明，根据不同直径球形BC数量百分比，在容器直径为4.9～6.8 cm时，中球占比较高，但容器直径为4.9 cm时，其中球BC质量占比只有27.78%，故容器直径在6.0 cm与6.8cm时，所产BC均匀度较好，但在6.0 cm时产量是6.8 cm的1.4倍，考虑到产量因素，在容器直径为6.0 cm时最佳。

2.4最优条件下生产稳定性分析

在上述最优条件下（发酵容器直径为6.0 cm，液深为2.40～2.75 cm，转速为130 r/min时）重复3次实验，表1结果表明椰冻驹形杆菌（Komagataeibacternataicola）Y19产量较为稳定，且中球BC质量与数量百分比均＞40%，均匀度较佳，故通过上述发酵条件的优化，能够获得较为稳定的生产。

表1　最优条件下生产稳定性分析Table 1 Ana lysis of production stability under the op timum conditions

3　讨论

转速提高、发酵液液深降低及发酵容器直径增大，均可使动态发酵时的供氧效率与剪切力提高。供氧效率增高，会提高BC合成的效率及产量，但过高的剪切力又会影响BC产量，YANG H等［16］也发现提高试验转速，颗粒直径减小同时颗粒表面的“刺突”状纤维丝增多，使颗粒间相互连结。杨雪霞等［19］报道了发酵罐培养时，对比转速较快的六叶平浆，采用转速较低的框式桨进行发酵时，细菌纤维素的产量最高。朱宏阳等［20］以解淀粉芽孢杆菌2F-7为考察菌株，以三角瓶为发酵容器，装液量从50/250 m L～100 m L/ 250 m L时，发现BC颗粒产率升高，且颗粒直径逐渐增大，当装液量为70 m L/250 m L颗粒均匀度最佳。因此需要寻找到剪切力与供氧效率之间平衡点［21］。

4　结论

通过本研究发现随着供氧效率的增加，剪切力增大，大球BC质量及数量百分比降低，小球BC质量及数量百分比升高，中球BC数量及质量百分比呈先增高后降低的趋势，故供氧效率与剪切力合适时，才能获得合适大小的球形BC且产量较高。实验以中球BC质量及数量百分比为评价指标，探索了转速，液深及发酵容器直径条件引起的供氧效率及剪切力变化对动态发酵产球形BC均匀度的影响，可以得出在转速为130 r/min时，液深为2.40～2.75 cm，发酵容器直径为6.0 cm时，中球BC质量与数量百分比均＞40%，能获得形貌均匀一致、大小适中的球形BC。本实验为动态发酵生产球形BC提供了参考，为进一步扩大生产奠定理论基础。

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Culture conditions for the sphere-like bacterial cellulose by dynamic fermentation

ZHANG Cui，BI Jicai，CHEN Huamei，WANG Yanmei，LIU Sixin，LI Congfa*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Bacterial cellulose（BC），especially sphere-like BC，as an excellent new biological material had been w idely applied in various fields.At present，the BC produced by dynamic fermentation was mainly irregular crumb，star shaped and filiform，and the application scope was lim ited. Therefore，it is urgent to obtain sphere-like BC w ith high uniformity by controlling the production conditions.During the dynamic fermentation，using Komagataeibacter nataicola Y19 as production strains，quality and quantity percent of sphere-like BC w ith medium size as the investigation indexes，the effects of the changes of supplying oxygen efficiency and shear force caused by rotate speed，fermented liquid depth and fermentation vessel diameter on the synthesis law of sphere-like BC were discussed.The results showed that the particle size of sphere-like BC was decreased and the quantity of sphere-like BC was increased w ith increasing the supplying oxygen efficiency and shear force.In the conditions of fermentation vessel diameter 6.0 cm，fermented liquid depth 2.40-2.75 cm and rotation speed 130 r/m in，the quality and quantity percent of sphere-like BC w ith medium size was more than 40%，and the uniform ity was up to the high set.

sphere-like bacterial cellulose；morphology of sphere-like bacterial cellulose；dynamic fermentation

TQ920．1

0254-5071（2016）05-0037-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．008

2016-03-08

海南省自然科学基金项目资助（314048）；海口市热带农产品深加工重点实验室项目（2013-45）

章翠（1990-），女，硕士研究生，研究方向为应用微生物技术。

李从发（1967-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。