漆酶的结构及其应用研究进展

李　平，易　弋，邓　春，伍时华，黎　娅*

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

漆酶的结构及其应用研究进展

李平，易弋，邓春，伍时华，黎娅*

（广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006）

漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，它通过将分子氧还原成水来氧化多种酚类和非酚类化合物。近年来，该酶已被应用于纺织、纸浆造纸以及食品行业，其也被运用于生物传感器和生物燃料电池的设计、医学诊断工具、生物修复剂进行清理除草剂、杀虫剂和修复含有炸药的土壤等方面。该文综述了漆酶的结构、作用机理、特性、生产及应用的研究进展，以期对该酶的深入研究提供一定的借鉴。关键词：漆酶；晶体结构；活性中心；工业应用

近年来，酶在工业应用中获得了极其重要的地位，漆酶（EC1.10.3.2）就是其中之一。该酶是一种含铜多酚氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属蓝色多铜氧化酶家族，是研究最早最多的酶系统［1］。漆酶最初是在漆树的分泌物中发现，广泛分布于高等植物、真菌分泌物、少量的细菌和昆虫中。在卷心菜、萝卜、土豆、梨、苹果及其他蔬菜中都有发现漆酶，并已从子囊菌纲、半知菌纲和担子菌纲的60余种真菌菌株中分离得到［2］。由于漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应。在植物体内，它主要是催化木质素的聚合过程，使木质素沉积，而真菌产生的漆酶则进行相反的过程，使木质素发生降解。

漆酶是一种糖蛋白，利用分子氧通过自由基-催化反应机制来催化氧化各种酚类和非酚类化合物。当底物经漆酶催化氧化时，底物失去一个电子，形成自由基，可发生进一步的氧化或非酶促反应，包括水合、歧化和聚合等反应。由于漆酶催化电子转移反应无需额外的辅助因子的能力，最近其已经被有效地应用到纳米生物技术中。而且生物分子的固定化技术也可用于保护漆酶的酶活性，为漆酶的应用提供了条件。

漆酶在食品工业、纸浆造纸工业、纺织工业、合成化学、化妆品、土壤生物修复、生物降解酚类环境污染物和环境激素的去除方面起着重要作用［3］。这些酶应用于纸浆去除木质素、农药或杀虫剂的降解、有机合成［2］、废物排毒、纺织染料改造、食品加工、生物传感器及其分析应用等方面。然而不同来源的漆酶氧化还原能力相差较大，这些差别决定于漆酶分子的结构。本文就近年来漆酶的结构及其特性、作用机理、生产及应用的研究进展做扼要综述。

1　漆酶的结构

在漆酶的结构中一般含有铜原子，这不仅是漆酶结构的共同特征，而且与其氧化还原功能紧密相关。铜离子参与漆酶活性中心的构建，共同构成漆酶结构中最重要的部分，决定着漆酶的活力和特异性，是结合底物及直接参与键断裂形成的区域。通过蛋白质晶体结构研究发现，大多数漆酶有3个铜离子结合位点，结合有4个铜离子。根据氧化还原电势、光学和磁学特征的不同，将其分为3种不同类型的铜离子：Ⅰ型Cu2+（T1Cu）、Ⅱ型Cu2+（T2Cu）和Ⅲ型Cu2+（T3Cu）［4］。这三种类型可以通过紫外可见光谱和电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）光谱来区分。在氧化状态下，T1Cu形成单核中心，在波长610 nm处有蓝色特征吸收峰（EPR检测）；T2Cu没有颜色显示，但能检测到EPR信号；T3Cu（2个T3Cu耦联于一个羟基上而形成了双核位点）没有EPR信号产生，但在近紫外区有弱吸收峰［5］。

T1Cu中心相对独立，并且都与两个组氨酸（His）的N和一个半胱氨酸（Cys）的S配位，形成扭曲的四面体结构，其中共价键Cu-S（Cys）的配位使漆酶呈现蓝色，是还原态底物的结合位点。T2Cu和T3Cu中心紧密相连形成一个三核铜簇。三核铜簇与8个His配位结合，其中T2Cu结合2个His，T3Cu结合6个His。T2Cu和T3Cu构成的三核铜簇是该酶催化的活性中心［6］（见图1）。

图1　漆酶活性中心结构Fig.1 Struc ture of laccase ac tive cente r

由于漆酶的含糖质量分数较高，一直难以获得用于X衍射分析的单晶，漆酶空间结构的研究进展受其阻碍。1998年Ducros制备了第一个Ⅱ型Cu缺失型漆酶晶体Lac-Cc（CcL：pdb注册号1A65）［7］，并解析了它的结构。此后，各种漆酶的三维结构相继得到报道［8］。图2a显示的是从热白丝菌（Melanocarpus albomyces）中获得的漆酶蛋白的三维结构，它含完整（四个）的铜原子活性。图2b从灰盖鬼伞菌（Coprinus cinereus）中获得漆酶基因，将其在米曲霉（Aspergillus oryzae）上表达进行研究。这是最早描绘的漆酶三维图。

图2　漆酶的三维结构Fig.2 Tertiary structure of laccase

已报道的漆酶一般具有相似的保护金属离子和调节其反应活性的蛋白质结构，其折叠一般称作杯蛋白（cupredoxin）型，被分成三部分结构域，三者紧密结合形成球状结构。这种结构形式是铜蓝蛋白家族所共有的。

2　漆酶作用机制

漆酶催化氧化反应需要氧气参与，催化氧化机理主要表现在底物自由基中间体的产生和氧气还原成水两个方面。首先T1活性位点的铜离子从还原态的底物吸收电子，底物被氧化形成自由基，进而导致各式各样的非酶促次级反应，如羟化、歧化和聚合等［9］。其次，T1活性位点的铜离子将单个电子通过Cys-His途径传递到T2/T3Cu三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧，氧接受T1Cu的电子，从而被还原成水［10］。漆酶中的4个铜原子在完成反应后都被氧化成Cu2+。氧分子还原成水主要经历了两步双电子反应：第一步形成超氧化物过渡体，第二步再生成水。

通过插入介体，可以使漆酶能够催化氧化非酚类物质。介体是漆酶能够催化氧化的低分子质量有机化合物。仅有漆酶的时候，非酚类化合物不能被高度活化的阳离子自由基氧化。最常用的合成介体有1-羟基苯并三唑（hydroxybenzotriazole，HOBT）、N-羟基邻苯二甲酰亚胺（N-hydroxyphthalimide，NHPI），2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）和3-羟基邻氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid）等［9］。

图3　漆酶催化氧化反应机理Fig.3 Reaction m echanism of laccase catalytic oxidation

对介体的研究表明在绝大多数非天然介体中都存在着N-OH的共同结构特征，而正是N-OH能够在漆酶的作用下生成自由基，然后通过生成的自由基去攻击大分子底物或者非酚型底物。目前，对漆酶应用的研究主要集中在漆酶及其介体系统上，特别是天然有效廉价介体的寻找是目前的一个研究热点。

3　漆酶特性

漆酶的结构决定了漆酶的特性。漆酶的来源很多（真菌、植物、昆虫、细菌），结构各异，因而也决定了不同的漆酶表现出来的特性相差很大。

3.1理化性质

漆酶一般含有520～600个氨基酸残基的多肽序列，且都有N-末端分泌肽。其氨基酸序列的同源性差异很大，不同来源的漆酶一般＜50%。不同来源的漆酶，其糖基化程度和糖基种类也不同，一般糖配基占整个分子的10%～45%。由于分子中糖基化的差异，漆酶的分子质量也随来源不同会有很大差异［11］。一般来说，大多数漆酶的等电点（isoelectric point，PI）值在3～5范围内变动。

3.2氧化特性

不同的漆酶的氧化能力不一样，而且其氧化方式也不尽相同，甚至完全相反。如植物漆酶氧化木质素单体形成木质素聚合物，而白腐真菌漆酶则降解或降聚木质素。漆酶能催化许多化合物的氧化反应，一些漆酶能高效地氧化抗坏血酸，另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。

3.3对抑制剂的敏感性

一般来说，不同抑制剂对漆酶活性的抑制作用不同，同种抑制剂对不同来源的漆酶的抑制作用也不同。大量研究表明，Co2+、Ni2+、Cd2+、Fe3+、Ag+等离子对酶活性的抑制作用很强，其原因可能是反应过程中，这些金属离子占据了漆酶的活性中心，改变了漆酶的结构，从而抑制了酶的活性［12］。此外，温度、pH值等也对漆酶活性有一定的影响。多数真菌漆酶的最适反应温度在20～50℃，但也有较耐高温的漆酶，如嗜热白腐真菌漆酶最适反应温度为70℃，60℃处理9 h仍具有完全活性［13］。多数漆酶在碱性环境中不稳定，易失活，其反应的最适pH值随来源和反应底物不同而不同。

3.4反应动力学

米氏常数（Km值）的大小可以反映出漆酶对底物亲和力的大小，而漆酶对底物的亲和力又是影响氧化底物速率的一个重要因素。漆酶催化氧化的底物广泛，不同种类的漆酶氧化底物的范围不同。一般情况下，只要底物具有相似于邻/对二酚的结构就能被漆酶氧化。在所能够催化氧化的底物上，一些真菌漆酶能够氧化的底物漆树漆酶不能氧化（如甲酚）。在催化氧化速率上，真菌漆酶也比漆树漆酶要快几倍甚至几十倍［14］。

4　漆酶的生产

漆酶是一些真菌在次生代谢过程中分泌的胞外酶，但不是所有的真菌都能产生漆酶，如接合菌纲和壶菌纲［15］。已有文献报道了通过枫香拟茎点霉（Phomopsis liquidambari）来生产漆酶的方法［16］。此外，一些因素也影响着漆酶的生产，如培养类型（液体或固体）、碳源、氮源等［17］。

4.1碳源和氮源的影响

将微生物分别培养在含有1%的酵母提取物和1%的不同碳源和氮源的合成培养基中。以葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖或乳糖作为碳源。由于阻遏作用，过多的葡萄糖和蔗糖会降低漆酶的产量。但这一问题可以通过使用聚合物为底物来改进提高，如使用纤维素［18］。以酵母提取物、蛋白胨、脲、硫酸铵或硝酸钠作为氮源。漆酶是通过消耗氮来触发产生的［19］。一些研究表明提高的漆酶活性可通过使用较低的碳/氮比实现，但也有其他研究表明其在较高的碳/氮比下也可以实现。

4.2温度的影响

在不同菌株之间，漆酶的最适温度有着显著差异。已经发现，在光照条件下漆酶生产的最适温度是25℃；在黑暗条件下，其最适温度是30℃［5］。漆酶生产的最适温度范围是25～30℃［20］。FARNET A M等［21］发现在40℃和50℃条件下对酶预温育可以大大提高漆酶的活性。担子菌漆酶在55℃活性最高，并且在20～60℃条件下酶蛋白结构稳定［22］。KIM H W等［23］发现，由嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）产生的漆酶最适温度为75℃，而且在85℃条件下其半衰期为50 min。

4.3pH的影响

在漆酶催化下，不同底物引起的反应不同，所以其最适pH值也不同。许多文献指出，漆酶的活性是对称型分布的。在高pH值时，酚类底物和T1Cu之间的电位差可以促进底物氧化，且氢氧根离子（OH-）结合到T2/T3三核铜簇中心，这些作用有助于确定漆酶的最适pH值［24］。CORDI L等［25］用丁香醛连氮作为底物，并在pH3.0～8.0的范围内确定pH值对酶活性的影响。L1（漆酶同工酶）的最适pH值为4.0，而L2的最适pH值为5.0。从扁韧革菌（Stereum ostrea）提取的漆酶在pH 6.0、40℃条件下活性最高［26］。当真菌生长在pH值为5.0的培养基中，会大量产生漆酶。大多数的研究表明，适合产酶的pH值是在4.5到6.0之间［5］。

4.4搅拌的影响

搅拌是另一种影响漆酶生产的要素。HESS J等［27］发现，当在搅拌罐反应器中培养真菌时会使菌丝受损，多色栓菌（Trametes multicolour）的漆酶产量也会大大降低。MOHORIM等［28］发现，在极低的搅拌速度下可实现白腐真菌烟管菌（Bjerkandera adusta）在搅拌釜式反应器中的培养。TAVARES A P M等［29］观察到，在由变色栓菌生产漆酶过程中搅拌并没有起到任何作用。

4.5诱导物的影响

漆酶一般都由漆酶产生菌低浓度发酵生产，但会在培养基中添加较高浓度的各种添加剂，如生物外源性化合物［30］。添加芳香族化合物能诱导增加漆酶活性，如2，5-二甲基苯胺、木质素、藜芦醇。藜芦醇是芳族化合物，在培养基中添加可增加漆酶的产量［31］。培养24 h后，加入2，5-二甲基苯胺，漆酶的诱导性能最高，可提高漆酶活性九倍。但由于其毒性，较高浓度的2，5-二甲基苯胺对漆酶活性有降低的效果。

漆酶的启动子区域的编码中包含特异的外源物和重金属的各种识别位点［32］。诱导物可以结合到识别位点，诱导漆酶的生产。YANG Y等［33］发现Cu2+和Fe2+等金属离子能诱导白腐真菌长绒毛栓菌（Trametes velutina）5930漆酶的基因转录和合成。此外，木质素结构相关的一些芳香族化合物也有相似作用，如丹宁酸、丁香酸、肉桂酸、没食子酸和愈创木酚。

4.6培养方式的影响

液态发酵和固态发酵是漆酶生产最常用的发酵方式。野生型丝状真菌通过不同的培养技术被用于大规模生产漆酶。

4.6.1液态深层发酵

液态深层发酵涉及微生物的富氧液体培养。真菌深层发酵的发酵液黏度是其主要问题。当真菌细胞生长，菌丝形成而阻碍了叶轮的转动，从而限制了氧气和物料传递。为了解决这些问题，已经采用了一些不同的方法。基于连续式生物反应器，已开发出了使用变色栓菌发酵的脉冲式反应器［34-35］。发酵液黏度、氧气和物料的传递问题也可通过细胞固定化来解决。LUKE A K等［36］报道，由于对粗糙脉孢菌的固定化，其可以进行为期4个月的持续产酶，且无酶失活。生产漆酶的最有效的方法是补料分批操作，通过它可得到相对较高的漆酶活性。

4.6.2固态发酵

固态发酵（solid state fermentation，SSF）是适合于使用天然底物（如农业废物）来生产酶，因为它们能够模拟真菌生长的自然条件［37］。木质素、纤维素和半纤维素中含有丰富的糖分，能促进真菌在发酵罐中生长，使过程更经济［38］。其主要缺点在于生物反应器的设计，其中热量和质量传递是受限制的。为生产漆酶，已经研究了一些不同的生物反应器配置，如浸没装置、膨胀床、托盘等，其中托盘获得的效果最好［39］。

许多农业废物［40-41］如葡萄籽、葡萄茎、大麦麸、棉杆、糖蜜废水和甘蔗渣也被用作漆酶生产的基质。但是，在固态和液态发酵中漆酶的生产都没有达到到最大水平，因此，进行长时间的发酵是必需的。

5　漆酶的应用

漆酶的重要性体现在它能够氧化有毒和无毒的底物。它应用于纺织工业、食品加工业、木材加工业、制药工业、化工等行业。这种酶是非常特殊的、生态可持续发展的、成熟的催化剂。

5.1染料脱色

纺织行业的湿法工艺会利用大量的水和化学品来进行。这些化学品包括各种无机化合物和有机化合物。当暴露于光、水和其他化学物质下，染料的化学结构是其褪色的阻力。漆酶能够降解染料（其中包括合成染料），所以以漆酶为基础的方法已被开发，并在此行业中沿用至今。

XU Y等［42］发现元蘑（Hohenbuehelia serotina）能够产生漆酶，且该酶能脱色多种染料。BENZINA O等［43］使用漆酶处理纺织工业污水，发现脱色，污水的毒性降低。以漆酶为基础的染发剂比传统染发剂刺激性更小，也更容易处理，这是因为漆酶代替了传统染料配方中的过氧化氢。

漆酶也可用于脱氯的过程。二甲基苯胺是一种漆酶诱导剂，其增加了脱氯活性，是因为其中溶解氧浓度降低了。ROMERO S等［35］发现，细菌嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）可以脱色一些合成染料（亚甲蓝、甲基绿、甲苯胺蓝、刚果红、甲基橙和粉红色）和工业废水。

5.2生物修复和生物降解

由于广泛地使用农药，使土壤、水和空气产生污染，造成了如今严重的环境问题。多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCB）、苯、甲苯、乙苯、二甲苯、多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）、五氯苯酚（pentachlorophenol，PCP）、1，1，1-三氯-2，2-二（4-氯苯基）乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）和三硝基甲苯（2，4，6-trinitrotoluene，TNT）等，都是已知能够致癌、致突变并能持久稳定的环境污染物质。

使用变色栓菌生物修复低水分和有机物含量的土壤中的农药阿特拉津，这在半干旱和地中海般的生态系统中是很常见的。BAUTISTA L F等［44］从变色栓菌中获得的漆酶可降解多种多环芳烃类化合物。一色齿毛菌（Cerrena unicolor）产生的漆酶，24 h、30℃条件下可降低的甘蔗渣中的木质素含量高达36%［45］。

5.3纸浆造纸

在工业造纸中，氯气和氧气为基础的化学氧化剂被用于分离和降解木质素。但这存在一些问题，如回收、成本和毒性等问题仍然没有得到解决。然而，在现有的漂白过程中，漆酶及其介体系统（laccase mediator system，LMS）可以很容易地实现，它可以部分替代纸浆中的二氧化氯，比化学法对环境更加友好［24］。

5.4食品加工

在食品工业中，漆酶用于在烘焙、果汁加工和废水的生物修复等过程中去除不良的酚类化合物。现如今，已开始广泛地使用酶来改善面包的质地、外观、味道和新鲜度。当漆酶加入到生面团，生面团的面筋结构的强度和烘烤效果得到改善，提高了烘焙产品的柔软度。漆酶还能应用于白酒、苹果和葡萄汁、啤酒、茶叶等饮料中，在这些饮料中会存在一些酚类化合物，其存在会使饮料发生浑浊和色泽的变化从而影响它们的品质，漆酶能够氧化其中的酚类，漆酶的处理能够有选择性的氧化酚类物质使得这些饮料既能够保持其风味，又能够降低它们的变色和变质的速度。2002年，M INUSSI R C等［46］的综述详细介绍了漆酶在食品中的应用。

5.5其他应用

漆酶不仅用于食品工业、造纸和纸浆工业、纺织工业，还有其他方面的应用。漆酶具有降低从垃圾处置场、畜牧场和纸浆厂中产生的气味的能力。由于漆酶催化的电子转移反应，无需额外的辅助因子，它们也可以用来作为生物传感器来检测各种酚类化合物和叠氮化物等。作为生物传感器的酶［47］，漆酶可以检测多巴胺、吗啡、可待因、儿茶酚胺等。最近，漆酶已被作为生物催化剂用于有机物质的合成，以及生物燃料电池的设计［48］。此外，漆酶还被用于对食品工业废水的生物修复，在生物修复过程中，污染物被生物转化为对环境无不良影响的状态。

6　结束语

漆酶是多功能的酶，催化氧化反应将分子氧还原成水。它们是广泛分布于高等植物和真菌中的多铜酶。能够降解木质素，并在许多白腐真菌中大量存在。它们能够使工业废水和污水进行脱色和解毒处理。对酚类和非酚类木质素相关化合物以及难降解的环境污染物的作用，使得研究人员把它们应用于不同的生物技术领域。它们可以有效地应用于纸浆造纸工业、纺织工业、异型生物质降解、生物修复和生物传感器等方面。因漆酶催化电子转移反应而无需额外的辅助因子的能力，其已用于纳米生物技术这一热门的研究领域。近来，几种技术（如自组装等）已经被开发用于生物分子的固定化。

本文阐述了漆酶在食品工业等几个领域有很大的应用潜力。然而，对于漆酶的大规模应用存在许多限制因素。其一就是缺乏以合理的成本生产大量高活性漆酶的能力。最近，正在探索生产漆酶的廉价来源。在这方面，工业废水管理这个新兴的领域正在开发其营养潜力而用于漆酶生产。除了固体废物，来自食品加工的工业废水也特别有前景。

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Research progress on structure and application of laccase

LI Ping，YI Yi，DENG Chun，WU Shihua，LI Ya*
（College of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

Laccases is a kind of copper-containing polyphenol oxidase and oxidize the degradation of various phenolic and non-phenolic compounds through the reduction of molecular oxygen to water.In recent years，laccases have been applied in textile，pulp and paper，and food industry.It is also used in the design of biosensors and biofuel cells，as a medical diagnostics tool and bioremediation agent to clean up herbicides，pesticides and to repair soil contained explosives and so on.This paper summarized the research progress of the structure，mechanism of action，characteristic，production and applications of laccases，so as to provide a certain reference for further research of laccase.

laccase；crystal structure；active center；industrial application

Q554

0254-5071（2016）05-0010-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．003

2016-01-29

柳州市科学研究与技术开发计划课题（2013E020602）；广西自然科学基金（2013GXNSFBA019081）

李平（1990-），男，硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。

黎娅（1980-），女，讲师，硕士，研究方向为微生物领域。