pH对费氏丙酸杆菌细菌素抑菌性的影响

郑丽雪，郭晨，谢建松，唐亚进，王立梅，齐斌，*（.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟25500；2.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏常熟25500）

pH对费氏丙酸杆菌细菌素抑菌性的影响

郑丽雪1，2，郭晨1，谢建松1，唐亚进1，王立梅1，2，齐斌1，*
（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500；2.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏常熟215500）

以实验室保存的一株费氏丙酸杆菌CS1420（Propionibacterium freudenreichii CS1420）为试验菌株。首先考察了不同初始pH下对其发酵产细菌素的影响。结果表明：以大肠杆菌ATCC25922为指示菌，当培养基初始pH为6.0时，细菌素抑菌效果最好；以Saccharomyces cerevisiae 2-10515为指示菌，当培养基初始pH为5.5时，细菌素抑菌效果最好。然后用丙酸调节细菌素粗提物的pH进行抑菌试验，结果表明，pH对粗提得到的细菌素抑菌性影响很大，当用丙酸将细菌素溶液的pH调至5.5时，细菌素的抑菌活性有显著提高。

费氏丙酸杆菌；pH；细菌素；抑菌性

丙酸杆菌属广泛存在于自然界中［1-2］，被分为两大类，一类是痤疮型丙酸杆菌［3］，另一类是乳品丙酸杆菌。乳品丙酸杆菌主要包括费氏丙酸杆菌（P.freudenreichii）、詹氏丙酸杆菌（P.jensenii）、特氏丙酸杆菌（P. thoenii）等，是从乳制品、青贮饲料中分离出来的无致病性的一类丙酸杆菌，现在食品工业中主要用于生产丙酸、维生素B12、叶酸、乳品发酵剂、发酵蔬菜、露芦糖等［4-6］。另外，乳品丙酸杆菌在代谢过程中会合成特殊的肽或蛋白质，这类代谢物（细菌素）是丙酸杆菌产生的异型抑菌物质，有很好的特性［7-9］，比如：其具有广泛的抑菌作用，且抑菌效果优于苯甲酸钠、山梨酸钾等常见的化学防腐剂，所以，丙酸杆菌细菌素在食品防腐保鲜中具有很好的应用前景，受到了研究人员的广泛关注。

如何去提高丙酸杆菌细菌素的抑菌活性是当前研究的热点问题，已有研究表明，pH对费氏丙酸杆菌细菌素抑菌性的影响很大。冯晗等［10］，荣绍丰等［11］分别研究了丙酸杆菌代谢物对恶臭假单胞菌、酵母菌的抑制活性，研究发现，pH越低，丙酸杆菌代谢物抑菌活性越高。马悦培等人［12］研究了不同初始pH对丙酸杆菌细菌素发酵的影响，结果显示，pH对丙酸杆菌细菌素发酵也有很大影响。基于此，本研究以实验室保存的一株费氏丙酸杆菌CS1420为实验菌株，一方面考察不同初始pH对其发酵产细菌素的影响，另一方面，本研究将发酵产物中的细菌素进行粗提处理，进一步考察pH对粗提得到的细菌素抑菌活性的影响，这方面的研究内容目前鲜有人涉及。此研究旨在为后续的扩大试验奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1菌种

费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，简称为P.freudenreichii CS1420）、大肠杆菌（ATCC25922）、酵母菌（Saccharomycescerevisiae2-10515，以下简称为S.cerevisiae 2-10515）：均为常熟理工学院生物与食品工程学院发酵工程中心保存。

1.2仪器

LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；FA604A型精密电子天平：上海精天电子仪器有限公司；LHR-250型霉菌培养箱：上海索谱仪器有限公司；CR22GⅡ型高速冷冻离心机：日本日立公司；SW-CJ-1B超净工作台：苏净集团安泰公司；Bio-Rad xMark酶标仪、Bio-Rad 1575洗板机：美国Bio-Rad公司；Milli-Q Advantage超纯水仪：美国Millipore公司。

1.3培养基

丙酸杆菌培养基：改良PYG培养基［13］；大肠杆菌培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL，pH 7.0；酵母菌培养基：PDA培养基［14］。

1.4菌种活化

将保存的P.freudenreichii CS1420菌株划线接种到改良的PYG固体培养基上，30℃厌氧培养2.5 d，连续活化两代。

挑取平板上活化好的大肠杆菌ATCC25922接种于营养肉汤培养基中，37℃培养12 h；挑取平板上活化好的S.cerevisiae 2-10515单菌落接种于PDA液体培养基中，30℃培养24 h。

1.5不同初始pH发酵的P.freudenreichii CS1420细菌素对大肠杆菌的抑制作用

将活化好的P.freudenreichii CS1420的种子液，分别接种到不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0）的改良PYG培养基中发酵培养10 d，每天取样，离心取上清液留样备用。取若干只试管，每只试管中加入1 mL活化好的大肠杆菌菌液和0.5 mL P.freudenreichii CS1420发酵上清液，以加1 mL的无菌的大肠杆菌培养基和0.5 mL无菌的PYG培养基作为空白对照，37℃条件下培养12 h，分别取200 μL于酶标板上，在酶标仪上读数测定OD620。考察不同初始pH条件下，不同发酵时间细菌素对大肠杆菌ATCC25922的抑制作用。每组试验做3个平行。

1.6不同初始pH发酵的P.freudenreichii CS1420细菌素对酵母菌的抑制作用

另取若干只试管，每只试管中加入1 mL活化好的酵母菌菌液和1.5中处理好的0.5 mL P.freudenreichii CS1420发酵上清液，以加1 mL的无菌的酵母菌培养基和0.5 mL无菌的PYG培养基作为空白对照，37℃条件下培养24 h，分别取200 μL于酶标板上，在酶标仪上读数测定OD560。考察不同初始pH条件下，不同发酵时间细菌素对Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用。每组试验做3个平行。

1.7不同pH对粗提得到的细菌素抑菌性的影响

将P.freudenreichiiCS1420发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10 min，在上清液中边搅拌边缓慢加入（NH4）2SO4粉末，使得（NH4）2SO4终浓度为70%，搅拌均匀后放置于4℃冰箱中沉淀过夜，然后于4℃、12 000 r/min条件下离心10 min，弃上清，将沉淀加水溶解后，用分子量为1 000 Da的透析袋透析48 h，然后将透析液进行冷冻干燥处理，冷冻干燥后加一定量的水溶解冷冻干燥后的沉淀物，并将其分成4份，分别用丙酸调节pH为5.1、5.3、5.5、5.7，分别取200 μL参照文献［15］中改动后的牛津杯-双层平板法进行抑菌试验，指示菌选用大肠杆菌ATCC25922。以此考察不同pH对纯化得到的细菌素抑菌性的影响。

2　结果与讨论

2.1不同初始pH发酵的P.freudenreichii CS1420细菌素对大肠杆菌抑制作用

不同初始pH发酵时细菌素对大肠杆菌抑制作用见图1。

不同初始pH发酵时，P.freudenreichii CS1420细菌素对大肠杆菌抑制作用如图1所示，其中0 d为空白对照组，由图可知，P.freudenreichii CS1420经不同初始pH发酵后，不同时间的发酵液均有抑制大肠杆菌ATCC25922的作用，但是发酵前几天抑菌作用不明显，随着发酵时间的延长，抑菌作用增强，发酵第8天～9天的代谢产物抑制作用最强，这和荣绍丰等人、冯晗等人的研究一致，即发酵后期（第8天左右）丙酸杆菌代谢物抑菌活性最高。另外，从图中可以明显看出，不同初始pH对P.freudenreichii CS1420细菌素抑菌性有很大影响，当初始pH为6.0时，P.freudenreichiiCS1420细菌素对大肠杆菌ATCC25922抑制作用最强。

图1 不同初始pH发酵时细菌素对大肠杆菌抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation on E.coli

2.2不同初始pH发酵的P.freudenreichii CS1420细菌素对酵母菌抑制作用

不同初始pH发酵时细菌素对酵母菌抑制作用见图2。

图2 不同初始pH发酵时细菌素对酵母菌抑制作用Fig.2　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation on yeast

不同初始pH发酵时，P.freudenreichii CS1420细菌素对酵母菌抑制作用如图2所示，由图可知，P. freudenreichii CS1420经不同初始pH发酵后，不同时间的发酵液对Saccharomyces cerevisiae 2-10515也都有抑制作用，同样是发酵前几天抑菌作用不明显，随着发酵时间的延长，发酵液抑菌作用增强，发酵第8天～9天的代谢产物抑制作用最强。另外，当初始pH为5.5时，P.freudenreichii CS1420细菌素对Saccharomyces cerevisiae 2-10515抑制作用最强。

2.3不同pH对粗提得到细菌素抑菌性的影响

根据2.1、2.2的试验结果，选取第 9天的 P. freudenreichii CS1420发酵液按照1.7方法进行盐析、透析、冷冻干燥等处理后，用丙酸调节其pH分别为5.1、5.3、5.5、5.7，进一步研究不同pH对粗提得到的细菌素抑菌性的影响，试验结果如图3所示。

图3　不同pH对细菌素抑菌性的影响Fig．3　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation

由图3可知，pH对粗提得到的细菌素抑菌性影响很大，牛津杯A中细菌素溶液形成的抑菌圈直径为12.8 mm，B为17.2 mm，C为23.3 mm，D为17.1 mm。结果表明，用丙酸将细菌素溶液的pH调节为5.5时，抑菌物质的抑菌活性有显著提高。所以，尽管丙酸杆菌细菌素具有广泛的pH耐受范围［16-17］，但在不同pH条件下，细菌素抑菌活性差别很大。

3　结论与展望

1）以大肠杆菌ATCC25922为指示菌，当培养基初始pH为6.0时，P.freudenreichii CS1420产细菌素抑菌作用最好；以Saccharomyces cerevisiae 2-10515为指示菌，当培养基初始pH为5.5时，细菌素抑菌作用最好。

2）用丙酸调节粗提处理后的细菌素溶液的pH，然后进行抑菌试验，结果发现，pH对粗提得到的细菌素抑菌性影响很大，当用丙酸将细菌素溶液的pH调至5.5时，抑菌物质的抑菌活性有显著提高。

发酵条件的优化与否直接影响到代谢方式及代谢流量的变化，从而影响目的产物的产量。国内外有学者针对细菌素产量做过发酵条件优化研究［18-20］，但是相关报道较少。所以，本研究待开展的工作是进一步对P.freudenreichii CS1420进行发酵条件的优化研究，得到发酵生产细菌素的最佳条件，然后结合本研究的结果，最终获取P.freudenreichii CS1420细菌素产生最大抑菌活性的条件，以期为工业化生产奠定理论参考。

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Effect of pH on Antimicrobial Activity of Propionibacterium freudenreichii Bacteriocins

ZHENG Li-xue1，2，GUO Chen1，XIE Jian-song1，TANG Ya-jin1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Propionibacterium freudenreichii CS1420 was as experimental strains.Firstly，the effects of different pH on fermentation of Propionibacterium freudenreichii Bacteriocins were investigated.The result showed：the antimicrobial activity were best by using Eoli ATCC25922 as indicator strains when the medium initial pH was 6.0，the antimicrobial activity were best by using Saccharomyces cerevisiae 2-10515 as indicator strains when the medium initial pH was 5.5.Then，bacteriocins crude extract pH were adjusted and then bacteriostatic experiments were carried out.The result showed：the effect of pH on crude extract bacteriocins was tremendous.The antimicrobial activity of bacteriocins improved significantly when crude extract bacteriocins solution pH were adjusted 5.5 with propionic acid.

Propionibacterium freudenreichii；pH；bacteriocins；antimicrobial activity

2015-09-10

江苏省科技支撑计划项目（BE2013339）；苏州市科技计划项目（SYN201226）；苏州市科技计划项目（SYN201417）；常熟理工学院大学生实践创新训练计划项目

郑丽雪（1982—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：食品生物技术。