挤压超声联用提取葡萄籽原花青素工艺优化

董兴叶，徐振秋，邓辰辰，许明君，曹苗苗，高如意（1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港222001；2.江苏康缘药业股份有限公司中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏连云港222001；3.江苏康缘药业股份有限公司中药提取精制新技术重点研究室，江苏连云港222001）

挤压超声联用提取葡萄籽原花青素工艺优化

董兴叶1,2,3，徐振秋1,2,3，邓辰辰1,2,3，许明君1,2,3，曹苗苗1,2,3，高如意1,2,3（1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏连云港222001；2.江苏康缘药业股份有限公司中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏连云港222001；3.江苏康缘药业股份有限公司中药提取精制新技术重点研究室，江苏连云港222001）

以经脱脂后的葡萄籽为原料，挤压-超声波联用法提取其中原花青素。采用单因素和正交试验确定最优工艺条件。研究结果表明，挤压处理最优条件：物料含水率10%、挤压温度100℃、螺杆转速120 r/min。超声提取的最优条件为：超声时间15min、超声波功率80W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度50%、处理温度45℃。按挤压-超声波联用最优工艺条件提取，原花青素的得率高达（4.41±0.07）%。

脱脂葡萄籽，原花青素，挤压-超声波联用法，得率

原花青素是儿茶素等经聚合而成的多酚物质。原花青素具有抗氧化活性、护肝解毒作用、抗菌作用及抗癌功能。

原花青素的提取有溶剂法、纤维素酶法和超临界萃取法等［1-4］。目前，提高得率研究都集中在高效的提取方法上，鲜见研究预处理对得率的影响。国内研究过超微粉碎处理过程及纤维素酶处理过程对其得率的影响［5-6］。但是未见研究挤压前处理对经脱脂后葡萄籽原花青素得率影响的报道。葡萄籽中的功能性成分被纤维素等构成的细胞壁所包围［5］，其中的原花青素以结合形式与蛋白质和纤维素结合在一起［6］。挤压作用时，物料中过热状态的水分子发生瞬间的气化蒸发，巨大的压力促使其形成多孔状结构［7-8］。本文以经脱脂后葡萄籽粉作为试验的原料，利用挤压脱脂葡萄籽粉后采用超声波提取原花青素，研究最佳的挤压和提取条件，通过与前期的试验得出的单纯超声波原花青素提取得率进行对比，以期为原花青素工业化制备和葡萄籽综合利用提供重要参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

葡萄籽：甘肃滨河食品工业集团葡萄酒下脚料，经挑选清洗干燥得到；原花青素标准品：成都曼斯特公司；无水乙醇、正丁醇、浓盐酸、石油醚（30℃～60℃）：等均为分析纯。

UV-2700型紫外分光光度计：日本导津；DL-120B型超声波清洗器：上海三信仪器有限公司；DS56-Ⅲ型双螺杆挤压膨化机：济南赛信膨化机械有限公司；R-1005旋转蒸发器：北京瑞成伟业仪器设备有限公司；R-LGJ-10D型真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；HC-1000Y微型试样粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1原花青素得率的测定

1.2.1.1原花青素含量的测定

标准曲线：采用正丁醇-浓盐酸法［5］，以原花青素标准品的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，结果表明原花青素浓度在上述范围内呈良好的线性关系，得出回归方程为：A=0.4650C－0.0160，R2=0.9999。

样品的测定：称取一定量的原花青素提取物，稀释一定体积后，按照标准曲线方法测定在550 nm处的吸光度，由吸光度可知样品中原花青素含量，再乘以相应的体积后即可算出提取得率。

1.2.1.2原花青素得率的计算计算原花青素得率的公式如下：

式中：C为根据标准曲线计算出的样品的浓度，mg/mL；V为样品稀释体积，mL；M为为经脱脂后葡萄籽粉质量，g。

1.2.2挤压膨化处理条件

经前期试验结果确定的超声提取原花青素条件：超声时间15min、超声波功率80W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度50%、处理温度45℃。挤压过程的条件优化试验均在上述条件下进行，研究物料含水率、挤压温度、螺杆转速对葡萄籽粉中原花青素得率的影响。在螺杆转速为120 r/min、挤压温度100℃条件下，物料含水率设为10%、15%、20%、25%、30%，研究其对原花青素得率的影响；在螺杆转速为120 r/min，含水率为上述优化出的结果，挤压温度设为80、90、100、110、120℃，研究其对原花青素得率的影响；物料含水率、挤压温度为上述优化出的结果，螺杆转速设为80、100、120、140、160 r/min，研究其对原花青素得率的影响。单因素试验后，通过三因素三水平的正交试验确定挤压处理过程最佳工艺参数。

1.2.3超声波处理条件

最佳挤压参数下处理后的原料进行超声波提取试验，研究超声时间、超声波功率、料液比、乙醇浓度、处理温度对原花青素得率的影响。在前期预实验的基础上，超声波功率80 W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度50%、处理温度45℃时，研究时间5、10、15、20、25 min对原花青素得率的影响；料液比1：20（g/mL）、乙醇浓度50%、处理温度45℃，时间为上述优化的结果，研究功率40、50、60、70、80、90W对原花青素得率的影响；乙醇浓度50%、处理温度45℃，时间、功率为上述优化的结果，研究料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）对原花青素得率的影响；乙醇浓度50%，料液比、时间、功率为上述优化的结果，研究温度25、35、45、55、65℃对原花青素得率的影响；料液比、时间、功率、温度为上述优化的结果，研究乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%对原花青素得率的影响。单因素试验后，通过三因素三水平的正交试验确定超声提取过程的最佳条件（乙醇浓度和处理温度采用单因素试验优化出的试验条件）。

1.2.4原花青素提取物的制备

脱脂葡萄籽粉的制备：清洗、干燥处理后的葡萄籽用粉碎机粉碎后，过筛，然后用600 mL石油醚浸泡葡萄籽粉200 g，浸泡12 h后再过滤、干燥即得。

挤压-超声联用法：脱脂葡萄籽粉→挤压处理→干燥粉碎过筛→超声提取→提取液减压浓缩→真空干燥→原花青素提取物。

1.2.5统计分析

所有试验均平行3次，采用SPSS 18.0进行数据分析。

2　试验结果与分析

2.1挤压处理条件优化

2.1.1物料含水率对得率影响的试验结果

物料含水率对得率影响的试验结果见图1。

如图1所示，物料中含水率增大，原花青素的得率会呈现下降的趋势。当含水率为10%时，得率达到最大值。这是因为物料中含水率适当时能使其中的纤维充分润湿膨松，纤维束在受到力的作用时会发生断裂和分子重组现象［9］。当含水率过低时，膨化机会发生堵塞，同时也会引起物料的焦糊。含水量过高，挤出时物料的流动性较大，挤出温度降低较迅速，改性作用不充分就被挤出，导致得率明显下降［10］。因此，物料含水率选择10%为宜。

图1　物料含水率对原花青素得率的影响Fig.1　Effect of material moisture content on proanthocyanidin yield

2.1.2挤压温度对得率影响的试验结果

挤压温度对得率影响的试验结果见图2。

图2　挤压温度对原花青素得率的影响Fig.2　Effect of extrusion temperaturet on proanthocyanidin yield

由图2可知，挤出温度逐渐增加时，原花青素的得率在增加。原因是适当的高温条件提高反应自由能，改性作用增强，有利于物料形成多孔状结构［10］。但是，挤压温度大于100℃时，得率呈下降的趋势。这是由于温度过高物料在机腔内焦糊并结成硬块，原花青素得率相应的降低［11-12］。因此，挤压温度选择100℃为宜。

2.1.3螺杆转速对得率影响的试验结果

螺杆转速对得率影响的试验结果见图3。

图3　螺杆转速对原花青素得率的影响Fig.3　Effect of screw speed on proanthocyanidin yield

如图3所示，在挤压机螺杆转速增加时，原花青素的得率会增加。这是因为螺杆转速在增加时，物料与螺杆及机筒之间的摩擦及剪切力增大，颗粒分解作用增强［12］。当转速超过120 r/min时原花青素得率开始下降。这是由于物料在机筒内停留时间短，导致反应不彻底。因此，螺杆转速选择120 r/min为宜。

2.1.4挤压处理正交试验

以物料含水率、挤压温度、螺杆转速为研究因素，采用正交试验进行优化，正交试验结果见表1、表2。

表1 挤压正交试验结果Table 1　Results of orthogonal experiment on ultrasonic extraction

表2方差分析Table 2　Analysis of variance

由极差试验结果可知，各因素对原花青素得率影响的顺序为挤压温度＞物料含水率＞螺杆转速。挤压原花青素的最优方案为A1B2C2，即物料含水率10%，挤压温度100℃，螺杆转速120 r/min。方差分析结果表明：挤压温度对挤压过程具有显著影响，物料含水率和螺杆转速对对挤压过程没有显著影响。因此，在最优方案下进行验证性试验，得率为（4.39±0.07）%。

2.2超声处理条件优化

2.2.1超声时间对原花青素得率的影响

超声时间对原花青素得率的影响结果见图4。

由图4可知，随着超声提取时间的不断增加，得率呈现递增的趋势。原因是破坏葡萄籽的细胞壁及原花青素与提取液达扩散平衡均需要一定的时间才能完成［13-14］。但当超声时间超过15 min时，得率出现下降。可能是超声作用过程中，原花青素先析出后被重新吸附导致［15］。因此，超声时间选择15 min为宜。

图4　超声时间对原花青素得率的影响Fig.4　Effect of the ultrasonic time on proanthocyanidin yield

2.2.2料液比对原花青素得率的影响

料液比对原花青素得率的影响结果见图5。

图5　料液比对原花青素得率的影响Fig.5　Effect of the ratio of liqiud to material on proanthocyanidin yield

由图5可知，随着料液比的增加，得率呈现递增的趋势。原因是提取时料液比越大，原料中的细胞内外溶质的浓度差就越大，对所要提取的活性成分的浸出十分有利。但料液比超过1∶20（g/mL）时，得率趋于稳定。这是由于原料中所要提取的活性成分的基本已全部溶出。如果继续增加提取溶剂既增加了成本，又会给浓缩等操作工序带来不必要的麻烦［16］。因此，料液比选择1∶20（g/mL）为宜。

2.2.3超声功率对原花青素得率的影响

超声功率对原花青素得率的影响结果见图6。

图6　超声功率对原花青素得率的影响Fig.6　Effect of the ultrasonic power on proanthocyanidins yield

由图6可知，超声功率在增加时，得率也在增加。原因是功率大时，提取液与原料接触次数相应的增多，与此同时空化作用增强能有效地破坏原料的细胞壁机构，使原花青素得率增加［17-18］。但超声功率大于80 W时，得率下降。这是由于超声功率过大时，已经空化的气泡没有足够时间爆破，空化作用相应的就会减弱，也有可能是大功率时，物理剪切作用使已经提取出来的原花青素结构被破坏［19］，得率下降。因此，超声功率选择80 W为宜。

2.2.4乙醇浓度对原花青素得率的影响

乙醇浓度对原花青素得率的影响结果见图7。

图7　超声功率对原花青素得率的影响Fig.7　Effect of ethanol concentration on proanthocyanidin yield

由图7可知，乙醇浓度在增加时，得率增加。这是由于原花青素属于多酚类物质，分子内部存在大量的羟基，使其具有一定的极性，当提取剂与原花青素的极性相当时［20］，得率最高。原花青素与提取溶剂极性相似度增加，原花青素溶出量增加。但乙醇浓度超过50%时，得率呈现下降的趋势。这是由于乙醇浓度继续增大，使两者的极性差距变大，原花青素溶解度降低，得率减少［20］。因此，乙醇浓度选择50%为宜。

2.2.5处理温度对原花青素得率的影响

处理温度对原花青素得率的影响结果见图8。

图8　处理温度对原花青素得率的影响Fig.8　Effect of the extraction temperature on proanthocyanidin yield

由图8可知，随处理温度增加，原花青素的得率呈现增加的趋势。原因是温度升高，分子运动程度加大，溶质的扩散作用增强，有利于原花青素的浸出。但处理温度超过45℃时，得率下降。这是因为原花青素热稳定性较差，原花青素酚型结构可能遭到破坏。因此，处理温度选择45℃为宜。

2.3超声波对原花青素得率影响的正交试验

上述最佳挤压参数下获取的原料进行超声波试验。由单因素试验结果可知，乙醇浓度、处理温度对原花青素的得率影响较小，因此选择料液比、超声功率和超声时间3个对原花青素的得率影响较大的因素进行正交试验（乙醇浓度和处理温度采用单因素试验优化出的参数），结果见表3、表4。

表3 超声波提取正交试验结果Table 3　Results of orthogonal experiment on ultrasonic extraction

表4方差分析Table 4　Analysis of variance

由极差试验的结果可以得知，各提取因素对原花青素得率影响的顺序为料液比＞功率＞时间。最优方案为A2B2C2，即超声功率80 W，超声时间15 min，料液比1∶20（g/mL）。方差分析结果表明：液料比对提取原花青素具有显著的影响，超声时间和超声功率对提取原花青素没有显著的影响。在正交试验中得到的理论最佳组合条件下测定原花青素得率，并做3组平行。得出挤压-超声波联用法得率高达（4.41±0.07）%。

3　结论

挤压处理最优条件为：物料含水率10%、挤压温度100℃、螺杆转速120 r/min。超声提取的最优条件为：超声时间15min、超声波功率80W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度50%、处理温度45℃。挤压-超声波联用法原花青素得率高达（4.41±0.07）%。经本实验室前期试验得出超声波法原花青素的得率仅为（3.18±0.06）%（试验条件：超声时间20 min、超声波功率80 W、料液比1∶25（g/mL）、乙醇浓度50%、处理温度45℃）。因此，与单纯的超声提取法相比，挤压-超声波联用法可以大幅度提高原花青素得率。

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Optimization of Extraction Technology of Proanthocyanidins from Grape Seeds by Extrusion in Conjunction with Ultrasound

DONG Xing-ye1，2，3，XU Zhen-qiu1，2，3，DENG Chen-chen1，2，3，XU Ming-jun1，2，3，CAO Miao-miao1，2，3，GAO Ru-yi1，2，3（1.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，Jiangsu，China；2.Jiangsu Kanion
Parmaceutical Co.，Ltd.，State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Lianyungang 222001，Jiangsu，China；3.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.，Ltd.，The Key Laboratory for the New
Technique Research of TCM Extraction and Purification，Lianyungang 222001，Jiangsu，China）

Extrusion in conjunction with ultrasonic treatment was used to extract proanthocyanidins from defatted grape seeds.The optimal extraction conditions by single factor test and orthogonal test were obtained.The results showed that the optimal extraction conditions of extrusion treatment were as following：material moisture content 10%，extrusion temperature 100℃and screw speed 120 r/min.The optimal extraction conditions of ultrasonic treatment were as following：the ultrasonic time 15 min，the ultrasonic power 80 W，the ratio of material to liquid 1∶20（g/mL），ethanol concentration 50%，the temperature 45℃.Under this condition，proanthocyanidins yield could reach up to（4.41±0.07）%.

defatted grape seeds；proanthocyanidins；extrusion in conjunction with ultrasonic treatment；yield

2015-09-18

重大新药创制（2013ZX09402203）

董兴叶（1988—），女（汉），工程师，硕士研究生，从事保健食品研发工作。