刺五加立枯病内生生防菌株的筛选

姜 威，李 晶，孟利强，张淑梅

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150020；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

刺五加立枯病内生生防菌株的筛选

姜 威1，2，李 晶1，2，孟利强1，2，张淑梅1，2

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150020；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

从健康刺五加植株的根、茎、叶中分离内生细菌，并对刺五加立枯病有拮抗作用的生防菌株进行了筛选。结果从刺五加各组织中共分离了48株内生菌，经鉴定分属于芽孢杆菌属、假单孢菌属、黄单孢菌属及短小杆菌属。其中有4株内生细菌对刺五加立枯病有拮抗作用，具有作为生防菌的潜能。

刺五加；内生细菌；拮抗作用

刺五加（Acanthopanax senticosus）是五加科五加属多年生植物，其根、茎、叶、果实入药材，具有强身健体、补肾安神、益气健脾之功效［1-2］。剌五加中有多种化学成分，刺五加苷B为其中的主要成分，具有促性腺等作用，可抗疲劳、增强适应性［3］。刺五加因为具有显著疗效和广泛药用价值而越来越受到人们重视，目前全国年需求量达到500万kg以上［4］。由于过量采挖，刺五加已经濒临灭绝，人工种植研究已成为重中之重。但是随着人工栽培范围的不断扩大，刺五加病害日益严重［5］。目前，刺五加种植中主要病害为刺五加苗期的立枯病，立枯病致病菌主要为立枯丝核菌，对刺五加苗期培育造成了严重的影响。苗期立枯病是植物在幼苗阶段由立枯丝核菌和镰刀菌等多种真菌引起的土传病害，发生面广，危害严重［6］。化学的防治使病原菌产生抗药性，并且破坏了土壤结构。

本试验从植物体内筛选对植物本身病害具有明显抑制作用的内生细菌，这些内生细菌可以主动从植物体表进入植物体内，在植物体内定殖，能更好地发挥其促生防病增产作用。因此，从刺五加植物体内筛选内生生防菌可能成为刺五加立枯病生物防治中重要的环节。

1 材料与方法

1.1 材料

培养基：马铃薯琼脂培养基（PDA）马铃薯250g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1 000mL。LB培养基胰蛋白胨10g，酵母膏5g，蛋白提取物5g。

样品来源：刺五加植株采自牡丹江林副特产研究所。

供试病原菌：立枯丝核菌（Acanthopanax senticosus）由黑龙江省森林保护研究所邓勋赠予。

1.2 方法

1.2.1 采集方法

在牡丹江市林副特产研究所刺五加的种植园区内2个实验基地内各选择2块样地，在每块样地根据刺五加生长情况、病虫害是否发生以及东西南北不同方向，共采集刺五加健康植株10株。分别采取健康刺五加植株的根、茎、叶组织装入无菌自封袋内，带回实验室4℃保存，尽快分离内生细菌。

1.2.2 消毒剂不同消毒时间的灭菌效果及检验

将刺五加各组织用自来水冲洗去除表面杂质，然后在超净工作台上进行表面的消毒：无菌水冲洗表面，滤纸吸去水分，将组织在95%乙醇中浸泡10s，晾干后浸在1%NaCIO溶液中消毒3 min、5 min、7 min、9 min、11 min和13min，无菌水冲洗3次，最后一次冲洗的无菌水取100uL涂LB平板，30℃培养24h，检验灭菌效果，每处理3次重复。

表面除菌率=（未消毒处理的植物表面细菌数-消毒处理的植物表面细菌数）/未消毒处理的植物表面细菌数100

1.2.3 内生细菌的分离

将消毒后的组织用无菌研钵磨碎后无菌水倍比稀释，取100uL均匀涂抹在LB培养基上，重复3次，30℃下倒置培养24～48h，观察菌落生长情况。挑取不同形态的菌落纯化、镜检并保存。

1.2.4 内生细菌种类鉴定

分离的内生细菌的鉴定主要参照《一般细菌常用鉴定方法》［7］进行鉴定。

1.2.5 拮抗菌筛选

内生菌的拮抗能力采用平板对峙培养法筛选。抑菌率（%）=（对照菌丝直径-处理菌丝直径）/对照菌丝直径×100

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间的灭菌效果

内生菌在分离的过程中，表面灭菌是关键，过轻或过重都会影响内生菌数量的准确性［8］。既要避免因为灭菌时间过短造成灭菌效果的不彻底，又要预防灭菌时间过长造成植物组织的伤害。实验结果显示，在分离刺五加内生细菌的过程中，2%NaCIO溶液消毒时间越长，内生细菌的数量越少。处理时间每延长2min，内生菌数量减少60%。最后结果显示5min为灭菌最佳时间。

2.2 内生菌的分离和鉴定

从刺五加的根、茎、叶中分离、纯化，获得内生细菌48株。对部分出现重复率较高菌株的菌落形态、生理生化特性和培养性状进行了测定。初步鉴定为芽孢杆菌属、假单孢菌属、黄单孢菌属和短小杆菌属，芽孢杆菌属出现率最高。内生菌不同种属主要特征如表1。

表1 内生细菌属的特性Tab.1 The chacteristics of endophytic bacteria strain

2.3 刺五加内生拮抗菌株的筛选

用平板对峙法测定了48株内生细菌对刺五加立枯丝核菌的拮抗作用。结果显示有4株内生细菌对立枯丝核菌有抑制作用，抑菌率分别为60.9%，71.2%，68.6%，88.5%。

3 讨论

研究表明，刺五加根、茎、叶组织内都存在大量的内生细菌。其种群密度分布是根中最多，其次为叶、茎。其中分离的四株拮抗细菌中，有3株来自刺五加根，1株来自刺五加叶。因此推植物根中内生生防菌株的含量可能为最高。内生细菌作为植物生态系统组成成分，相对于PGPR、附生细菌更具备优势，更又助于生防作用的发挥。筛选出的生防细菌的作用如何，需要结合田间试验加以证实，为开发防治刺五加立枯病生防资源提供基础。

［1］ 程海涛，李春丰，罗志文.刺五加营养器官中总皂苷积累动态研究［J］.黑龙江医药科学，2012，35（2）：40-41.

［2］ 程昆木，郑友兰.不同年份刺五加中刺五加苷含量分析［J］.安徽农业科学，2009，37（30）：14707-14708.

［3］ 张宝香，杨义明，姜英，等.刺五加不同树龄与不同采收期折干率及总皂苷含量的研究［J］.特产研究，2010，（02）：52-53.

［4］ 赵敏，王炎，康莉.刺五加果实及种子内源萌发物质活性的研究［J］.中国中药杂志，2001，26（8）：534-535.

［5］ 邓勋，宋小双.九种杀菌剂对刺五加苗木立枯病菌的室内毒力测定［J］.黑龙江农业科学，2012，（10）：54-57.

［6］ 李世东，缪作清，高卫东.我国农林园艺作物土传病害发生和防治现状及对策分析［J］.中国生物防治学报，2011，27（4）：433-440.

［7］ 中国科学院微生物所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法［M］.北京：科学出版社，1978.

［8］W.L.Barraquio，L.Revilla，J.K.Ladha.Isolation of endophytic bacteria fromwetland rice［J］.Plant and Soil，1997，（194）：15-24.

Screening of acanthopanax senticosus seedlings endophytic bacteria strains

JIANG Wei1，2，LI Jing1，2，MENG Li-qiang1，2，ZHANG Shu-mei1，2
（1.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China；2.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China）

We isolate endophytic bacteria from root，stem and leaf ofacanthopanax senticosus，and the antagonistic effect of biocontrol strains were screened for its blight.48 strains of endophytic bacteria were isolated from the tissues of the acanthopanax senticosus.They belong to bacillus sp.，pseudomonas sp.，xanthomonas sp.and curtobacterium sp.There are four strains of endophytic bacteria antagonistic to rhizoctonia solani ofacanthopanax senticosus，and they have potential for biological control ofacanthopanaxsenticosusdisease.

Acanthopanaxsenticosus；Endophytic bacteria；Antagonistic effect

S567.19

A

1674-8646（2016）16-0008-02

2016-07-09

黑龙江省科学院青年基金项目

姜威（1986-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，助理研究员，从事微生物药学研究。

张淑梅（1969-），女，黑龙江哈尔滨人，博士，研究员，从事微生物药学研究，e-mail：shumeizhang@Yhoo.com。